Este estudio recibió apoyo financiero de NINR (F32NR013611). Nos gustaría reconocer y agradecer a los desarrolladores de AnalyzeSkeleton(2D/3D) y FracLac (Arganda Carreras et al y Karperien et al., respectivamente) sin que el análisis aquí descrito no sería posible.

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis.">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).</li><li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. 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A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice.">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li><li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+histological+sections:+Application+to+mammary+gland+tissue.">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li><li>Davis, B. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Las células de microglía están finamente sintonizadas a la fisiología y la patología dentro de sus micro-dominios y mostrar una amplia gama de morfologías2 en sutil7,14 y grave lesión8. El uso de protocolos de ImageJ hace cuantificación de morfología microglia accesible a todos los laboratorios como la plataforma y los plugins son una imagen de la abrir-fuente software de procesamiento. Mientras que el protocolo descrito se centra en el procesamiento de imágenes y análisis de uso de este software, la consistencia de recopilación de datos, validez y confiabilidad comienza con excelente IHC y microscopía. Este protocolo se utiliza para mejorar el binario, el esqueleto y representaciones de contorno de microfotografías de todos y de las células pero no puede tomar el lugar de pobre tinción IHQ y microscopia que resulta en bajo contraste, borrosas o distorsionadas imágenes. Como una consideración adicional, se debe tener cuidado no a aplanar el tejido cerebral durante el almacenamiento, antes de seccionar, que irrevocablemente altera la morfología de la microglia. Por último, dentro de cada experimento, microglia debe ser reflejada utilizando la misma escala, así como el mismo microscopio. Software, instrumentación y objetivos varían entre microscopios que resultará en Microfotografías de tamaño diferentes a pesar de objetivos similares y cambiar el detalle así como el número de células en cada marco. Por ejemplo, adquisición de imágenes con objetivo 40 X sobre una Leica SPII resultados en dos veces el número de células y menos detalle de adquisición con un Zeiss 880. Esto es particularmente importante para la célula ramificación datos recopilados de toda la trama en lugar de una sola célula, como esto se convierte en un problema de muestreo de datos.
En general, Análisis esquelético que utiliza la microfotografía todo precede el análisis fractal de célula única por dos razones. Ramificación de célula determinante de todas las células en una microfotografía es rápida en comparación con el análisis de fractal de la célula y puede ser considerado como una herramienta de detección si el tiempo es un factor. Además, las imágenes binarias derivadas durante el análisis del esqueleto se utilizan para el análisis fractal. Una vez reflejado, hay una serie de pasos críticos que pueden influir en los resultados del análisis del esqueleto e introducir usuario influencia. Los pasos de protocolo que son más variables entre los usuarios son paso 4.2 (cada vez mayor brillo de la imagen) y paso 4.5 (determinar el umbral). Siempre que sea posible, un número óptimo para aumentar el brillo (max o min deslizante entre 0-255) determina y llevó a cabo constante para todas las imágenes y los usuarios. Donde la variabilidad de la imagen es grande, el usuario puede elegir en su lugar un brillo que variará entre imágenes. Alternativamente, si las imágenes son brillantes y el contraste es alto, entonces aumentando brillo puede omitirse y umbral puede estandarizarse usando un filtro de umbral de especialidad (por ej., Huang) en lugar de la predeterminada más variable. Una vez optimizado, los parámetros deben seguirse para reducir al mínimo la influencia de usuario adicional.
Un ejemplo de la variabilidad de usuario se presenta en la figura 5. Fueron aumentados los valores de datos de usuario 1 y usuario 2 y por lo tanto se incrementaría la variabilidad si usuario 1 y usuario 2 contribuyeron a la recolección de datos. Un ejemplo de las diferencias en el usuario 1 y usuario 2 imágenes binarias y esqueletizadas destacan por círculos de colores (figura 5). En este caso, ambos usuarios fueron brevemente capacitados estudiantes con experiencia limitada en la microglia. Regular supervisión y tutoría de un experto junto con protocolo mayor formación2 microglia pueden reducir la variabilidad inter-usuario. Aunque no evaluado aquí, análisis fractal es menos sujeto a variabilidad inter-usuario porque las células binarias son manualmente e individualmente aisladas de una fotomicrografía, en lugar de confiar únicamente en el umbral para determinar formas de microglia. Sin embargo, todos los métodos poseen cierta variabilidad entre los usuarios. Por lo tanto, un único usuario (idealmente, entrenado por algo de experiencia en las células de la microglia) deben completar la recolección de datos para un conjunto de datos completo.
Modificaciones adicionales pueden hacer fácilmente en el presente Protocolo y dependerán de la calidad de imagen y los esfuerzos realizados para reducir el ruido y asegurar conectividad de proceso. Por ejemplo, si el contraste es adecuado, máscara de desenfoque no es necesaria y puede omitirse. Es prudente optimizar y completar el protocolo para un conjunto específico de imágenes, casos experimentales y controles, antes de recoger datos de un conjunto. Por último, plugins adicionales puede utilizarse en lugar de otros para aclarar y enfocar imágenes que no fueron descritos en el presente Protocolo como dilatar o afilar.
Ventajas de este protocolo son la disponibilidad universal y su adaptabilidad. Además, evaluar la ramificación de la célula usando AnalyzeSkeleton es rápido y aplicable a una microfotografía todo. Una ventaja del enfoque de análisis múltiples de la célula es el foco de toda una región en lugar de las células. Por lo tanto, es posible evaluar rápidamente la ramificación promedio (en términos de puntos finales y la duración de proceso) de microglia todos dentro de la imagen. Análisis esquelético proporciona un análisis de varias celdas: una muestra de datos en términos de números de celular que no pueden ser igualadas por el análisis fractal debido a la inversión de tiempo necesario para aislar las células de las fotomicrografías. Una instancia donde esto podría ser más adecuado sería en investigación de morfologías de microglia en cercanías a una lesión focal. Una limitación es la representación de la imagen de todo campo para crear modelos de esqueleto de microfotografías de IHC es imperfecta en comparación con el enfoque de unicelular más desperdiciador de tiempo. Además, un análisis de la región no es adecuado a las circunstancias donde microglia morfologías muy distintas dentro del mismo campo. Por último, este método de análisis depende de recuento de células, un parámetro que puede diferir entre las condiciones experimentales.
Análisis fractal se lleva a cabo en una sola célula y por lo tanto complementa la salida de datos de ramificación promedio células resultantes del análisis del esqueleto. Aunque mucho más tiempo, esta inversión produce una amplia gama de datos morfométricos. De la célula por ejemplo, densidad, proporción de palmo, y datos de circularidad, describen el tamaño, alargamiento y la forma del contorno de la célula, respectivamente. Lagunaridad y dimensión fractal Resumen la complejidad de la célula y la heterogeneidad de la forma, respectivamente. En el manual interactivo16 se ofrece un resumen más detallado de cómo cada parámetro se calcula y cómo se pueden interpretar datos y tal detalle debe ser considerado en relación a la pregunta de investigación específica. Los resultados del protocolo descrito en herramientas sensibles para cuantificar pequeños cambios en la morfología de microglia 2D que puede ocurrir en condiciones fisiológicas y patológicas. Análisis morfométrico adicionales tales como solidez, convexidad y factor de forma16,20 pueden ser posible si generar formas 3D.
Adaptación y desarrollo del protocolo es continua y orientados al usuario. Se ha ampliado de fluorescencia8 DAB/brillante-campo imágenes7 sino no tejido embebido en parafina. Además, puede ser utilizado en conjunción con software propietario como Imaris para análisis adicional. Este protocolo se puede aplicar a una variedad de la fisiología y no se limita a la microglía pero puede aplicarse a cualquier célula o tejido con patrones particulares o formas que se pueden identificar mediante métodos IHC. Por último, con suficiente tamaño de muestra, un análisis multivariante o cluster se puede aplicar para estratificar microglia según morfología12,21; Esto es información significativa como morfología de la microglia es un indicador vital de las funciones de la microglia y las respuestas a su entorno. El aprecio por la diversidad morfológica de microglial es importante comprender las interacciones neurona-glia-vascular durante la salud y la enfermedad y en expansión. Crecimiento en este campo se enriquece con protocolos bien desarrollados, fácil de usar y reproducibles para cuantificar y resumir microglia morfología utilizando múltiples variables continuas.

Microglia tienen una respuesta inmediata y diversidad morfológica a las alteraciones en la fisiología de cerebro1 a lo largo de un continuum de posibilidades que van desde morfologías hyper ramificación y muy complejas a la ramificada y ameboides morfologías2 . Microglía también puede llegar a ser polarizado y barra-formado3. Ramificación de células de microglía se define comúnmente como una forma compleja con múltiples procesos y se divulga a menudo como el número de puntos finales por la célula y la duración de los procesos de la célula. Puesto que la microglia finalmente se ajustan a la función neuronal y glial a célula continua Charla cruzada y en vivo la motilidad4,5, morfologías de microglia pueden servir como indicadores de diversas funciones y disfunciones en el cerebro. Un enfoque cuantitativo es necesario para describir adecuadamente la diversidad de estos cambios morfológicos y distinguir las diferencias entre las células ramificadas que se producen con sutiles perturbaciones fisiológicas (como la epilepsia5,6 y conmoción cerebral7) además de lesión grave (como movimiento8). Un mayor uso de morfología cuantificación7,8,9,10,11,12,13,14 revelará la completa diversidad de morfologías de microglia en salud y enfermedad. El presente estudio los datos del progresivo uso de plugins ImageJ es necesario resumir la morfología de la microglía de fluorescentes o fluorescentes no Microfotografías de microglia adquirió en tejido fijo de roedor después de inmunohistoquímica (IHQ).
Central a las técnicas de análisis aquí descritas son el ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, desarrollado en 2010 para cuantificar grandes estructuras mamarias y FracLac16, desarrollado en 2014 para integrar análisis ImageJ y fractal cuantificar formas individuales de la microglia. Estos plugins proporcionan un análisis rápido de ramificación de la microglia en Microfotografías de todos o microglia múltiples de un ROI definido dentro de una microfotografía. Este análisis puede utilizarse sola o en complemento con el análisis fractal. El análisis fractal de unicelular (FracLac) requiere una inversión de tiempo pero proporciona múltiples salidas de morfología con respecto a la complejidad de microglia, tamaño y forma. El uso de ambas herramientas no es redundante, como célula de ramificación es complementaria a la complejidad de la célula y la combinación de varios parámetros puede utilizarse para distinguir entre microglia diversas morfologías dentro de conjuntos de datos12,17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">primary antibody anti-IBA1</td>
			<td style="width:173px;">Wako&#160;</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td style="width:167px;">rabbit host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield soft mount</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunorResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>donkey host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 mL glass vial</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>UX-08923-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

Microglia son fagocitos del cerebro que participan en la homeostasis cerebral y examinar continuamente su entorno por la disfunción, lesiones y enfermedad. Como los primeros respondientes, microglia tienen funciones importantes para atenuar la disfunción de la neurona y glia, y en este proceso, se someten a una amplia gama de cambios morfológicos. Morfologías de la microglia pueden clasificarse descriptivamente o, alternativamente, se pueden cuantificar como una variable continua para parámetros tales como ramificación de la célula, la complejidad y la forma. Mientras que los métodos para cuantificar la microglia se aplican a las células, algunas técnicas se aplican a múltiples microglia en una microfotografía todo. El propósito de este método es cuantificar múltiples y las células disponibles protocolos de ImageJ. Este protocolo es un resumen de los pasos y plugins ImageJ recomendadas convertir Microfotografías de campo claro y fluorescencia en imágenes representativas binarias y esqueletizadas y analizarlos utilizando plugins de software AnalyzeSkeleton (2D/3D) y FracLac para la recolección de datos de morfología. Morfología de la célula en términos de puntos finales del proceso, ensambladuras y longitud, así como complejidad, forma celular, descriptores de tamaño un resumen de las salidas de estos plugins. El protocolo de Análisis esquelético descrito es idóneo para un análisis regional de microglia múltiples dentro de un todo microfotografía o región de interés (ROI), mientras que FracLac proporciona un análisis de células individuales complementarios. Combinado, el protocolo proporciona un objetivo, la herramienta de evaluación sensible y completa que puede utilizarse para estratificar entre microglia diversas morfologías presentes en el cerebro sano y lesionado.

Los protocolos de análisis de morfología microglia descritos Resumen pasos útiles en el procesamiento de fluorescentes y Microfotografías de DAB para el análisis morfométrico. Estos pasos se resumen visualmente en la figura 2 y figura 3. El objetivo de estos pasos es crear una imagen representativa de binario y esqueleto que modela adecuadamente la microfotografía original tal que los datos acumulados son válidos. Después de la aplicación del Protocolo, el plugin de AnalyzeSkeleton resulta en una imagen esqueleto etiquetado de que el número de puntos finales y rama (es decir., proceso) resumir lengthcan de archivos de salida resultantes. Extremos y datos de longitud de proceso entonces se utilizan para estimar el grado de ramificación de la microglia en la microfotografía o ROI. Figura 4 se resumen los datos resultantes (extremos de la célula y el proceso largo/célula) recolectados con y sin la aplicación del protocolo. Mientras que existen tendencias similares, la información resumida en la figura 4F es menos variables que en figura 4E. Además, estos datos ilustran el aumento de la sensibilidad para detectar diferencias entre grupos cuando se aplica el protocolo. Por último, debe tenerse cuidado con respecto a la variabilidad inter-usuario en la aplicación del protocolo. Estas diferencias se resumen por figura 5 donde el mismo conjunto de datos fue analizado por dos usuarios independientes aplicando un protocolo idéntico como resumido arriba.
Se recogen datos adicionales de la morfología de las células aisladas de las imágenes binarias creadas durante la aplicación del protocolo. Los pasos del protocolo para analizar la morfología de la microglia antes y usando el plugin de FracLac se resumen en la figura 6. Ilustramos este análisis en ambas lesionadas (figura 6A) y lesiones del tejido (Figura 6B). Imágenes representativas de binario, contorneado, convex hull/encapsulado círculo y ejemplos de cuenta de caja para cada célula analizada con y sin el protocolo de aplicación se muestran en la figura 6–F. Estas imágenes ayudan a ilustrar los orígenes de las diferencias en datos de morfología que se resumen en la figura 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> Figura 1. Ilustraciones de microglia esqueletizado con un soma circular (subóptimo) versus un soma de origen (óptimo) y la correspondiente superposición entre el esqueleto de la célula y la microfotografía original. Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> Figura 2. Protocolo aplicación fluorescentes fotomicrografías. Ilustraciones del esqueleto análisis protocolo aplicado a una microfotografía fluorescente con una sola célula recortada para mostrar detalles. Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> Figura 3. Aplicación de protocolo para campo brillante DAB fotomicrografías. Ilustraciones del Protocolo de análisis del esqueleto que una microfotografía DAB de campo claro se aplica con una sola célula recortada para mostrar detalles. Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> Figura 4. Análisis de datos con y sin la aplicación del protocolo. (A) una microfotografía de ejemplo de IHC fluorescente y célula cultivada correspondiente a la caja de amarillo (B). Imágenes binarias y esqueleto de ejemplo con (C) y sin (D) del Protocolo de aplicación como se describe. Datos de Resumen de microglia extremos de la célula y el proceso largo/celda de ileso (blanco) y lesiona el tejido cortical (gris) con (E) y sin (F) el protocolo aplicado. Análisis estadístico mediante la prueba t de student y n = 3, ** denota p < 0.01. Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> Figura 5. Diferencias de usuario con la aplicación del protocolo. Un ejemplo de una conversión de imagen y protocolo original a imágenes binarias y esqueletos por usuario 1 y usuario 2. Diferencias entre las dos imágenes se resaltan con círculos de colores a juego. Gráficos Resumen de microglia extremos de la célula y proceso de datos de la longitud celular en regiones del cerebro lesionadas y lesionados por usuario 1 y usuario 2. Análisis estadístico con ANOVA y muestra el tamaño es n = 3; p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> Figura 6. Análisis fractal con y sin la aplicación del protocolo. Ejemplo de fotomicrografías recortadas de microglía en el ileso (A) y herido (B) la corteza con binario correspondiente (C) e imágenes de esquema (D) que resultan con y sin el protocolo aplicado. El casco convexo asociado (azul) y que encierra círculo (rosa) para las formas de contorno correspondiente (E) se utilizan para calcular la densidad de forma, proporción y circularidad (G) del palmo. La caja cuenta método es ilustrada en (F) y utilizada para cálculos de lagunaridad (λ) (G) y dimensión fractal (DB). Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglía son células inmunes del cerebro que encuesta y reaccionan a la fisiología alterada del cerebro a través de cambios morfológicos que pueden evaluarse cuantitativamente. Este protocolo describe un ImageJ basado en protocolos de análisis para representar la morfología de la microglia como datos continuos según métricas tales como ramificación de la célula, la complejidad y la forma.

Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

quantifying-microglia-morphology-from-photomicrographs

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

66.1K vistas.  University of Arizona. Microglía son células inmunes del cerebro que encuesta y reaccionan a la fisiología alterada del cerebro a través de cambios morfológicos que pueden evaluarse cuantitativamente. Este protocolo describe un ImageJ basado en protocolos de análisis para representar la morfología de la microglia como datos continuos según métricas tales como ramificación de la célula, la complejidad y la forma.

Video: Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Investigación

Neurociencias

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

El agotamiento selectivo de la microglía de cerebeloso gránulos Cultivos Celulares El uso de L-leucina metil éster

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during development, homeostasis, and disease. Although macrophages have been studied in detail for decades, specialized features of microglia, the tissue-resident macrophages of the CNS, have remained largely mysterious, in part due to limitations in the ability to recapitulate mature microglial properties in culture. Here, we illustrate a straightforward procedure for the rapid isolation of pure microglia from the mature rodent brain. We also describe serum-free culture conditions that support high levels of microglial viability over time. Microglia cultured under these defined-medium conditions exhibit elaborate ramified processes and dynamic surveillance behavior. We illustrate some effects of serum exposure on cultured microglia and discuss how these serum-free cultures compare to both serum-exposed cultures as well as microglia in vivo.

Efforts to understand microglial function in detail have been hindered by the lack of microglial culture models that recapitulate the properties of mature in vivo microglia. This protocol describes an isolation and culture approach designed to maintain robust survival of highly ramified mature rat microglia under defined-medium conditions.

Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

Visualización de la morfología de los astrocitos usando la iontoforesis amarilla de Lucifer

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ

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