Las actividades de investigación de los autores están respaldadas por donaciones del Instituto Nacional de Salud al Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).

Los protocolos para la ligación de la arteria carótida parcial de ratón y el aislamiento de la aorta de ratón y la arteria carótida para la inmunotinción en la cara son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IBT 2014-9231). 1. Ligadura de la arteria carótida parcial izquierda <ol><li> Prepare el espacio quirúrgico colocando una almohadilla calefactora de 12 pulgadas x 14 pulgadas sobre la mesa y cubra la almohadilla y la parte superior de la mesa con un gran paño quirúrgico limpio. Ajuste el brazo del soporte del brazo para que el campo de visión del estereomicroscopio esté en el área central de la almohadilla calefactora. </li><li> Encienda la almohadilla calefactora de la mesa y ajuste el control de 3 posiciones al nivel de calor medio. A esta temperatura, la superficie de la placa quirúrgica (véase 1.6.1) será de 38-40 ° C. <ol><li> Coloque una jaula limpia en otra almohadilla de calefacción. Gire la almohadilla de calefacción como en el caso anterior. Esta jaula se utilizará para la recuperación después de la cirugía (véase 1.16), así como la vivienda. </li></ol></lI&gt; <li> En la mesa quirúrgica, coloque una bolsa de esterilización esterilizada en autoclave que contenga tijeras de iris (1 par), pinzas de tejido (1 par), pinzas de agarre súper (2 pares), tijeras de resorte (1 par) (1), sutura de seda 6-0 esterilizada, aplicadores con punta de algodón, mini aplicadores con punta de algodón, cortinas quirúrgicas y esponjas de gasa de 2 &quot;x 2&quot;. También coloque una botella de compresión que contenga etanol al 70% y otra que contenga clorexidina en la mesa quirúrgica. </li><li> Pesar un ratón. El peso corporal es necesario para determinar la cantidad apropiada de analgesia, que se administrará inmediatamente antes de la cirugía. </li><li> Coloque un ratón en la cámara de inducción. </li><li> Encienda el tanque de oxígeno y el vaporizador anestésico para anestesiar el ratón en la cámara de inducción. Mantener el nivel de isoflurano al 2%. Tarda 3-5 minutos antes de que el ratón deje de moverse. <ol><li> Mientras el ratón está siendo anestesiadoColoque una pieza más pequeña de un paño quirúrgico estéril (24 pulgadas x 24 pulgadas) debajo del microscopio estereoscópico para crear una superficie quirúrgica. A continuación, coloque un tablero de cirugía acrílica (que se ha limpiado con alcohol al 70%) en la superficie cubierta. Por lo tanto, la placa quirúrgica debe estar sobre la almohadilla calefactora pero separada por dos capas de cortinas quirúrgicas. </li></ol></li><li> Cuando el ratón deje de moverse en la cámara de inducción, transfiera el ratón a un área de preparación prequirúrgica y coloque su nariz en el cono nariz conectado al vaporizador (isoflurano al 2%). Retire el cabello alrededor del área cervical con un recortador eléctrico o una loción depilatoria. Se recomienda la eliminación del vello ya que este método no produce piezas de pelo sueltas, que son difíciles de eliminar por completo de la zona quirúrgica. </li><li> Con el cono de la nariz en su lugar, mover el ratón a la placa quirúrgica. <ol><li> Tape hacia abajo las patas delanteras derecha e izquierda en la placa quirúrgica. Tape hacia abajo ambas patas traseras togeEn el lado derecho del ratón. Esto provoca una ligera rotación del cuerpo del ratón de tal manera que el lado izquierdo del área del cuello del ratón se posiciona mejor para la cirugía. </li></ol></li><li> Desinfecte el área de la incisión con alcohol al 70%, exfoliante quirúrgico de clorhexidina y otra vez con alcohol al 70%. Cubra el ratón con un paño quirúrgico esterilizado excepto por el área de la incisión cervical. </li><li> Confirme con un pellizcado que el ratón esté completamente anestesiado y administre analgesia (Caprofen 3-5 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal o subcutánea. </li><li> Bajo el microscopio de disección, realice una incisión en la línea media ventral alrededor del área cervical usando un scalpel o tijeras de iris. NOTA: Utilizamos tijeras porque la distancia de trabajo del estereomicroscopio es limitada, lo que dificulta el uso de un bisturí. </li><li> Exponer la arteria carótida común izquierda (LCCA) empujando a un lado y reposicionando las glándulas salivales que cubren los vasos sanguíneos al lado izquierdo de la aNimal </li><li> Identificar todos los vasos sanguíneos en el campo quirúrgico ( Figura 1 ). La LCCA se bifurca en la arteria carótida interna izquierda (ICA) y en la arteria carótida externa izquierda (ECA). La arteria tiroidea superficial (STA) surge de la ECA en el lado medial. La arteria occipital (OA) suele surgir de la ECA, pero en algunos ratones surge de la ICA. </li><li> Ligado todas las ramas de la arteria excepto la OA utilizando sutura de seda esterilizada 6-0. Para lograr esto, realizar las siguientes dos ligaciones. <ol><li> Suavemente retire el tejido conectivo alrededor y debajo de la arteria carótida interna izquierda (ICA). Agarrar un trozo de sutura de seda precortada 6-0 (~ 2,5 cm) con pinzas y pasarlo por debajo de la arteria. Usando otro par de pinzas, tire de la sutura aproximadamente 1/3 de su longitud y ligue la arteria. </li><li> Quitar el tejido conectivo alrededor de la arteria carótida externa izquierda (ECA) de la misma manera descrita anteriormente y hacer una ligadura proximal a la tiroides superior izquierdaD (STA) ( Figura 1 ). Tenga cuidado de no dañar las fibras nerviosas que corren dentro del campo quirúrgico. </li></ol></li><li> Cuando estas ligaduras se han hecho, devolver las glándulas salivales a la posición original e hidratar el campo quirúrgico mediante la colocación de 2-3 gotas de solución salina estéril. Cierre la piel con suturas Vicryl revestidas 6-0. </li><li> Después de la cirugía, coloque el ratón en la jaula precalentada (ver 1.2.1). El ratón debe despertar en 5 minutos y comenzar a caminar. Una vez confirmado que el ratón se comporta normalmente, traiga la jaula a la sala de alojamiento de animales. </li><li> Observe el ratón diariamente durante los primeros 3 días de recuperación. El ratón puede mantenerse mientras el experimento requiera bajo las diversas condiciones que el protocolo experimental requiere. Las preparaciones faciales pueden hacerse en cualquier momento después de la cirugía. </li></ol> 2. En Face Immunostaining <ol><li> Eutanasia un ratón con CO 2 por sobredosis por inhalación. </li><li>Tape el ratón en una posición supina (lado del vientre hacia arriba) en una tabla de disección. </li><li> Exponga la cavidad abdominal haciendo una incisión en la línea media usando tijeras de iris. </li><li> Exponga la cavidad torácica cortando las costillas lateralmente al esternón. </li><li> Hacer un corte en la vena cava o cortar una de las arterias femorales para drenar la sangre. </li><li> Insertar una aguja de 26 G unida a una instalación de perfusión por gravedad (120 cm de presión de agua) en el ápice del ventrículo izquierdo y perfundir el sistema circulatorio con solución salina que contiene heparina (40 U / mL). Continúe la perfusión hasta que la solución salina que sale del corte se vuelva clara. </li><li> Cambiar el sistema de perfusión de solución salina a la solución de fijación que contiene paraformaldehído al 4% en PBS (solución salina tamponada con fosfato) y continuar perfusando durante 5 minutos más. </li><li> Cosecha de la aorta y las arterias carótidas izquierda y derecha utilizando tijeras de extremo romo y fórceps, y colocar en un tubo cónico de 50 ml que contiene el fijador en hielo. </li><li&gt; Transfiera el recipiente a una placa de Petri que contenga PBS bajo un microscopio de disección y retire cuidadosamente la grasa y los tejidos conectivos unidos a la aorta y las arterias carótidas. Separar y dividir la aorta y las arterias carótidas longitudinalmente para exponer el endotelio ( Figura 2 ]. </li><li> Se transfiere cada recipiente por separado a un pocillo de una placa de 12 pocillos que contiene 0,5 ml de una solución permeabilizante (0,1% Triton X-100 en PBS) por pocillo. Permeabilizar los vasos sanguíneos durante 10 min con balanceo a temperatura ambiente (RT). </li><li> Lave brevemente con PBS. </li><li> Para bloquear los sitios de unión a anticuerpos no específicos, incubar los vasos sanguíneos en suero normal al 10% de la especie animal en la que se han hecho los anticuerpos secundarios, en TTBS (solución salina tamponada con Tris (TBS) con Tween 20 al 2,5%) durante 30 minutos con Balanceándose a la RT. </li><li> Incubar los vasos con los anticuerpos primarios debidamente diluidos en TTBS con suero normal al 10% (como se ha descrito anteriormente) durante la noche con balanceo a 4 ° C. El nivelDe dilución debe determinarse para cada anticuerpo. </li><li> Realice la siguiente tinción de control. <ol><li> Incubar los vasos con TTBS en lugar de un anticuerpo primario seguido de incubación con un anticuerpo secundario. </li><li> Incubar los vasos con TTBS que contengan suero no inmune (o preinmunitario) o Ig del mismo animal (especie) en el que se hayan realizado anticuerpos primarios, seguido de incubación con un anticuerpo secundario. </li><li> Omitir la incubación con un anticuerpo secundario. Estas muestras de control deben manipularse de la misma manera y al mismo tiempo cuando se realiza la tinción con anticuerpos específicos. </li></ol></li><li> Lave los vasos sanguíneos 3 veces con TTBS durante 10 minutos cada uno con balanceo a RT. </li><li> Incubar con anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente diluidos apropiadamente en TTBS con suero normal al 10% (como se ha descrito anteriormente) durante 1 h con balanceo a RT. La tinción nuclear con DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) puede realizarse simultáneamente con unT en esta etapa añadiendo 1/5000 en volumen de una solución madre de DAPI que contiene 5 mg / ml de DAPI en H2O. </li><li> Lavar 3 veces con TTBS durante 10 min cada uno con balanceo a RT. </li><li> Enjuague brevemente en PBS. </li><li> Coloque una gota del reactivo anti-fade en un cristal de cubierta (22 mm x 50 mm) y coloque un vaso sanguíneo en el cristal de la cubierta con el endotelio hacia abajo. </li><li> Coloque un cristal de diapositivas (22 mm x 75 mm) en el vaso sanguíneo evitando las burbujas de atrapamiento. </li><li> Coloque la diapositiva en un paño de laboratorio limpio ( por ejemplo, Kimwipe) y cubra la diapositiva con dos piezas de trapo de laboratorio. Coloque suavemente 3,5 kg de peso ( por ejemplo, use una botella de agua en un libro grueso) en la diapositiva durante un máximo de 5 min para aplanar la muestra de vaso sanguíneo en la cara. </li><li> Retire el peso y limpie el exceso de solución alrededor de la cubreobjetos. </li><li> Aplique esmalte de uñas en las 4 esquinas de la cubreobjetos, coloque las diapositivas en una caja de diapositivas, con el lado de la tapa hacia arriba y manténgala en la oscuridad a la RT(O 4ºC) durante la noche. Este proceso aplana el tejido más lejos y hace más fácil hacer la microscopía con aumentos grandes. </li><li> Selle el cubreobjetos completamente usando esmalte de uñas. </li><li> Realizar la microscopía tan pronto como el esmalte de uñas esté seco. </li><li> Si es necesario, guarde los portaobjetos a -20 ° C. </li></ol>

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</ol>

Al manejar los vasos sanguíneos del ratón, es importante recordar que el endotelio es frágil y que cualquier fuerza mecánica excesiva dañará las células endoteliales. Por ejemplo, las células endoteliales se rompen o se separan de la pared del vaso si el vaso es perfundido con demasiada fuerza, lo cual puede suceder fácilmente cuando la vasculatura se perfunda usando una jeringa manual. Para obtener una presión de perfusión constante, utilizamos un sistema de perfusión por graved...

Para los estudios histopatológicos por microscopía óptica, se procesan rutinariamente trozos tridimensionales de tejidos biológicos para la incrustación de parafina seguido de seccionamiento y tinción. Una muestra de tejido que ha sido embebida en parafina puede ser varios milímetros en las tres dimensiones. Sin embargo, para el propósito de la microscopía óptica, debe ser primero seccionado de modo que la luz pueda pasar a través y entonces teñido de modo que la sección delgada produzca bastante contraste para la proyección de imagen. Debido a que las muestras seccionadas suelen tener un espesor de 5-10 μm, se ve sólo una fracción muy pequeña de la muestra entera en dos dimensiones a la vez. Es posible recolectar secciones secuenciales y, después de imaginar cada sección individualmente, realizar reconstrucción asistida por computadora de las imágenes 3D, pero esto es un trabajo tedioso. La histopatología de los vasos sanguíneos, especialmente para estudiar la patogénesis de la aterosclerosis, presenta problemas únicos. La aterosclerosis es una enfermedad focalizada que se desarrollaLocalmente en áreas donde se produce un flujo sanguíneo alterado. Además, la enfermedad se inicia dentro de la íntima, un tejido fino que consiste en una monocapa de células endoteliales y matriz extracelular, de grandes arterias. Por estas razones, es un reto localizar y estudiar las lesiones tempranas usando vasos sanguíneos seccionados porque uno puede faltar fácilmente seccionar la lesión. Incluso si una sección incluye un área enferma, se verá sólo una porción de 5-10 μm que contiene células endoteliales y otras células de pared vascular en los medios y adventicia. Las preparaciones de montaje completo en la cara (pronunciado än fäs) nos permiten examinar una amplia área de la superficie del vaso sanguíneo tal como la aorta entera de la raíz aórtica hasta las arterias ilíacas comunes. Utilizando una muestra de este tipo teñida con anticuerpos específicos y otras sondas específicas, se puede señalar la ubicación de las lesiones y también donde varios eventos moleculares se producen en las células endoteliales en conjunción conLa aterogénesis tal como cambios en la expresión, localización y modificaciones postraduccionales de proteínas. Además de estudiar la aterogénesis, la forma de las células endoteliales observada en las preparaciones faciales se utiliza como un indicador del patrón regional de flujo sanguíneo promedio en el tiempo. Tales datos son importantes para estudiar la señalización mecánica de células endoteliales in situ. Para este propósito, los vasos sanguíneos histológicos transversales de corte rutinario no son útiles. Por lo tanto, para la medicina vascular y la biología, es especialmente importante adquirir una técnica para fabricar preparaciones en la cara de los vasos sanguíneos que permite observar una amplia área de la superficie del vaso, así como las áreas subsuperficiales más profundas del vaso. Como revisado por Jelev y Surchev 1 , los biólogos vasculares han desarrollado varios métodos para observar el revestimiento de los vasos sanguíneos en la cara. Algunos métodos ingeniosos se desarrollaron en los años 1940 y 1950. Usando estos métodos, fueron<html> Capaz de estudiar la organización fundamental de las células endoteliales que recubren la superficie interna de los vasos sanguíneos. Sin embargo, debido a la forma en que se preparan estas preparaciones de en-face (el denominado método de Hautchen 2 , 3 , 4 o desprendimiento de la superficie del recipiente 5 ) y la forma en que se tiñe la muestra, no siempre fue posible obtener muestras morfológicas ininterrumpidas Información de la superficie del vaso en las áreas más profundas de la pared de los vasos sanguíneos. La preparación completa de vasos enmarcados combinados con tinción por inmunofluorescencia nos permitió no sólo estudiar la morfología de las células endoteliales y la expresión y localización de proteínas en estas células, sino también extender dichos estudios a la región subendotelial de la pared del vaso. Los primeros estudios que usaban vasos sanguíneos en preparados para la cara manchados con inmunofluorescencia empezaron a aparecer en los años ochenta 6 ,Con el advenimiento de la microscopía confocal de barrido láser y más recientemente la microscopía multifotónica, ahora se pueden obtener imágenes claras en foco de la estructura de la pared de los vasos sanguíneos en muestras de vasos endoblados con inmunofluorescencia así como la red vascular en animales vivos 8 , 9 , 10 , 11. Estas técnicas de formación de imágenes basadas en ordenador crean imágenes seccionadas ópticamente en foco y, apilando dichas imágenes, se pueden obtener imágenes tridimensionales reconstruidas de la pared del vaso y de la red vascular en los tejidos. Puede generar imágenes de una sección hecha a lo largo del eje Z de la imagen reconstruida 12 , 13 . En este artículo, ilustraremos un método para preparar preparaciones en la cara de la aorta de ratón y la arteria carótida para tinción inmunofluorescente. Preparaciones para el rostroPueden hacerse incluso después de que estos vasos hayan sido manipulados experimentalmente. Por ejemplo, una arteria carótida puede ser parcialmente ligada y después una preparación de cara preparada después de tal cirugía. Por esta razón, también describiremos en este artículo cómo realizamos una ligadura parcial en la arteria carótida. En comparación con la fabricación de preparaciones similares de animales más grandes tales como ratas, conejos y seres humanos, los vasos de ratón son de pequeño tamaño y más frágiles, requiriendo así un cuidado adicional durante el aislamiento quirúrgico de los vasos y preparándolos para la tinción de anticuerpos y la microscopía. Debido a que el modelo animal más utilizado para la modificación genética es el ratón, resulta crítico que muchos investigadores manejen los vasos de ratón sin dañarlos. En este manuscrito, vamos a describir cómo manejar los vasos sanguíneos del ratón cuando se hacen preparaciones en la cara de la aorta del ratón y la arteria carótida. Para fines de demostración, se utilizarán ratones C57 / b6 de tipo salvaje.

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9788429</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>12556005</td><td></td></tr><tr><td>6-0 coated vicryl suture</td><td>Ethicon</td><td>J833G</td><td></td></tr><tr><td>AF488 goat anti-rat IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>AF546 goat anti-rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>Sc-8304</td><td></td></tr><tr><td>Aoto Flow System</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch</td><td>Cardinal Health</td><td>4024</td><td></td></tr><tr><td>Blunt retractors, 2.5 mm wide</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>Caprofen (Rimadyl)&amp;nbsp;</td><td>zoetis</td><td>NADA#141-199</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine Scrub, 2%</td><td>Med-Vet International</td><td>RXCHLOR2-PC</td><td></td></tr><tr><td>Curity gauze sponges 2 x 2</td><td>Cardinal Health</td><td>KC2146</td><td></td></tr><tr><td>Electric heating pad, 12 x 14</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0667724</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393059</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Equitech-Bio</td><td>GS05</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P-36935</td><td></td></tr><tr><td>Puritan cortton swabs</td><td>VWR</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Mini cotton tipped aplicators</td><td>VWR</td><td>82004-050</td><td></td></tr><tr><td>Round handled Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>Silk Suture 6/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5601</td><td></td></tr><tr><td>Strabismus Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>Super Grip Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>Transparent Dressing</td><td>Cardinal Health</td><td>TD-26C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

en face preparation of mouse blood vessels

Secciones de los tejidos embebidos en parafina se utilizan habitualmente para el estudio de histología de tejidos e histopatología. Sin embargo, es difícil determinar cuál es la morfología tridimensional del tejido de tales secciones. Además, las secciones de los tejidos examinados pueden no contener la región dentro del tejido que sea necesaria para el propósito del estudio en curso. Esta última limitación obstaculiza los estudios histopatológicos de los vasos sanguíneos ya que las lesiones vasculares se desarrollan de manera focalizada. Esto requiere un método que nos permita examinar una amplia área de la pared de los vasos sanguíneos, desde su superficie hasta regiones más profundas. Todo un montaje en la cara preparación de los vasos sanguíneos cumple con este requisito. En este artículo, vamos a demostrar cómo hacer preparaciones en la cara de la aorta del ratón y la arteria carótida y inmunofluorescentemente mancha para la microscopía confocal y otros tipos de imágenes basadas en fluorescencia.

En la Figura 3 se muestra una imagen típica de inmunofluorescencia en cara del endotelio. Esta imagen muestra una única sección óptica de una aorta del ratón tomada cerca de la abertura de una arteria intercostal (el área oscura grande en forma de huevo). La aorta se tiñó doblemente con anti-VE-cadherina (verde) y anti-VCAM-1 (molécula de adhesión celular vascular-1) (rojo). Cada célula endotelial se delinea con una tinción lineal verde en la unión de adhere...

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En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Se describe un procedimiento para preparar preparaciones en la cara de la arteria carótida de ratón y la aorta. Tales preparaciones, cuando se tiñen inmunofluorescentemente con anticuerpos específicos, nos permiten estudiar la localización de proteínas y la identificación de tipos de células dentro de toda la pared vascular por microscopía confocal.

En Face Preparación de los vasos sanguíneos del ratón

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

21.0K vistas.  University of Texas MD Anderson Cancer Center.  Se describe un procedimiento para preparar preparaciones en la cara de la arteria carótida de ratón y la aorta. Tales preparaciones, cuando se tiñen inmunofluorescentemente con anticuerpos específicos, nos permiten estudiar la localización de proteínas y la identificación de tipos de células dentro de toda la pared vascular por microscopía confocal. 

Video: En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Murine Spinotrapezius Model to Assess the Impact of Arteriolar Ligation on Microvascular Function and Remodeling

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. Its unique anatomy makes the spinotrapezius useful for investigation of ischemic injury and subsequent microvascular remodeling. Here, we demonstrate an arteriolar ligation model in the murine spinotrapezius muscle that was developed by our research team and previously published1-3. For certain vulnerable mouse strains, such as the Balb/c mouse, this ligation surgery reliably creates skeletal muscle ischemia and serves as a platform for investigating therapies that stimulate revascularization. Methods of assessment are also demonstrated, including the use of intravital and confocal microscopy. The spinotrapezius is well suited to such imaging studies due to its accessibility (superficial dorsal anatomy) and relative thinness (60-200 &mu;m). The spinotrapezius muscle can be mounted en face, facilitating imaging of whole-muscle microvascular networks without histological sectioning. We describe the use of intravital microscopy to acquire metrics following a functional vasodilation procedure; specifically, the increase in arterilar diameter as a result of muscle contraction. We also demonstrate the procedures for harvesting and fixing the tissues, a necessary precursor to immunostaining studies and the use of confocal microscopy.

We demonstrate a novel arterial ligation model in murine spinotrapezius muscle, including a step-by-step procedure and description of required instrumentation. We describe the surgery and relevant outcome measurements relating to vascular network remodeling and functional vasodilation using intravital and confocal microscopy.

Modelo murino Spinotrapezius para evaluar el impacto de la ligadura arteriolar en la función microvascular y Remodelación

The murine spinotrapezius is a thin, superficial skeletal support muscle that extends from T3 to L4, and is easily accessible via dorsal skin incision. ...

Investigación

Medicina

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.
IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 &plusmn; 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 &#181;g/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 &#181;g/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Inmunología e Infección

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

La purificación de los buques de cerebro de ratón

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Neurociencias

<meta charset="utf8"></head><body>Visualización de pericitos retinianos mediante limpieza de tejidos y marcaje fluorescente

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

Bioquímica

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

Dolicoctasia: demencia vascular y Alzheimer

A Visual Approach for Inducing Dolichoectasia in Mice to Model Large Vessel-Mediated Cerebrovascular Dysfunction

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to enter and expel excessive amino acids or toxins from the brain. To model how the BBB can be compromised in diseases like vascular dementia (VaD) or Alzheimer's disease (AD), researchers developed novel methods to model vessel dilatation. A compromised BBB in these disease states can be detrimental and result in the dysregulation of the BBB leading to untoward and pathological consequences impacting brain function. We were able to modify an existing technique that enabled us to inject directly into the Cisterna magna (CM) to induce dilatation of blood vessels using elastase, and disrupt the tight junctions (TJ) of the BBB. With this method, we were able to see various metrics of success over previous techniques, including consistent blood vessel dilatation, reduced mortality or improved recovery, and improving the fill/opacifying agent, a silicone rubber compound, delivery for labeling blood vessels for dilatation analysis. This modified minimally invasive method has had promising results, with a 19%-32% increase in sustained dilatation of large blood vessels in mice from 2 weeks to 3 months post-injection. This improvement contrasts with previous studies, which showed increased dilatation only at the 2 week mark. Additional data suggests sustained expansion even after 9.5 months. This increase was confirmed by comparing the diameter of blood vessels of the elastase and the vehicle-injected group. Overall, this technique is valuable for studying pathological disorders that affect the central nervous system (CNS) using animal models.

Autor destacado: Modelado de las contribuciones vasculares a la enfermedad de Alzheimer en ratones transgénicos

We demonstrate chemically inducing large blood vessel dilatation in mice as a model for investigating cerebrovascular dysfunction, which can be used for vascular dementia and Alzheimer's disease modeling. We also demonstrate visualizing the vasculature by injecting silicone rubber compound and providing clear visual guidance for measuring changes in blood vessel size.

Un enfoque visual para inducir dolicoectasia en ratones para modelar la disfunción cerebrovascular mediada por grandes vasos

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to ...

En Face Preparación de los vasos sanguíneos del ratón

Resumen

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Modelo murino Spinotrapezius para evaluar el impacto de la ligadura arteriolar en la función microvascular y Remodelación

Vasodilatación de los vasos aislados y el aislamiento de la matriz extracelular de la piel-apretado ratones

La purificación de los buques de cerebro de ratón

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción

Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

Un enfoque visual para inducir dolicoectasia en ratones para modelar la disfunción cerebrovascular mediada por grandes vasos

Un enfoque visual para inducir dolicoectasia en ratones para modelar la disfunción cerebrovascular mediada por grandes vasos