Damos las gracias a Wendy salmón y Nicki Watson de la instalación Keck en el Instituto Whitehead del MIT para la formación de imágenes.

1. Preparación de DC2.4 y RAW 264.7 Líneas Celulares NOTA: La línea celular similar a macrófagos RAW 264.7 y la DC2.4 línea de células dendríticas son tanto de origen murino, y se utilizaron las siguientes condiciones para cultivar las células. <ol><li> Crecer células RAW 264.7 en DMEM (medio de Eagle Mínimo de Dulbecco) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado (FBS) a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2. </li><li> Se cultivan las células DC2.4 en condiciones similares con la de las células RAW 264.7, salvo el uso del medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) suplementado con L-glutamina en lugar de DMEM. </li></ol> 2. Preparación de conjugados fluorescentes Partículas: Perlas de C. albicans, zimosán, recubiertas de IgG- <ol><li> Cultivo de Candida albicans <ol><li> Inocular C. albicans cepa SC5314 de un stock de glicerol congelado en 25 ml de YPD suplementado con Uri (2% Bacto-peptona, 1%extracto de levadura, 2% de glucosa y 80 mg / ml uridina) durante la noche a 30 ° C. NOTA: Evitar crecer el cultivo de Candida más de una DO 600 de 12. </li><li> Tomar 1 ml de la C. albicans y girar hacia abajo a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento con 1 ml de PBS. </li><li> Recoger el precipitado por centrifugación a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Repita el paso 2.1.4. </li><li> Calcular la multiplicidad de infección (MOI) de C. albicans en relación con el número de fagocitos y proceder con el ensayo de fagocitosis tal como se describe en la sección 3. Un OD 600 de 1 es equivalente a 2,5 x 10 7 Candida albicans por 1 ml. NOTA: Generación de Candida-BFP se describe en la referencia 13. </li></ol></li><li> Preparación de zimosán y perlas recubiertas con IgG NOTA: Zymosan es una que contiene β-glucano-preparación de partículas de hidratos de carbono por hongos que deriva de Saccharomyces cerevisiae. Zymosan se conoce para evocar señales inflamatorias en los macrófagos y las células dendríticas, y se ha utilizado ampliamente en estudios de fagocitosis 13, 14, 15. <ol><li> En resumen vórtice del tubo que contiene el material en partículas, y la alícuota una cantidad suficiente para un experimento en un tubo de 1,5 ml. NOTA: Por lo general usamos relación 1:10 (para una celda, añadir 10 zymosan partículas o perlas recubiertas con IgG). </li><li> Añadir 1 ml de PBS enfriado en hielo, y recoger las partículas por centrifugación durante 1 min a 10.000 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en PBS 1 ml de hielo-frío. </li><li> Repita los pasos 2.2.2-2.2.3 NOTA: Continúe con el punto 2.2.5 o almacenar el tubo a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Sonicar las partículas de 10 seg en baño de ultrasonido ultrasónico (120 V, 50 a 60 kHz) con el fin de evitar unany la agregación de partículas. </li></ol></li></ol> 3. La fagocitosis NOTA: La fagocitosis es un proceso complejo que se inicia con la unión de las partículas en la superficie celular de los fagocitos a través de la interacción de PRRS con ligandos sobre la superficie de la partícula. La unión es seguido por el montaje de actina y sus proteínas asociadas en el sitio de contacto, y la formación de una taza de fagocitosis. El desmontaje posterior actina se produce en el fagosoma y da lugar a la inmersión completa de las partículas. A continuación se describen las diferentes etapas de la fagocitosis. <ol><li> Ensayo de unión NOTA: La finalidad de este experimento es para controlar la primera etapa de la fagocitosis que implica la interacción entre los ligandos sobre las partículas diana y los receptores en los fagocitos. <ol><li> Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alterntivamente, células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 ó 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de cristal. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2. NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o una técnica similar. </li><li> Colocar el portaobjetos de cámara (o placa) a 10 ° C durante 10 min. </li><li> Retire con cuidado el medio de cada pocillo usando una pipeta o un aspirador. PRECAUCIÓN: Realice este paso cuidadosamente como cada pocillo de un sistema de cámaras cubreobjetos es pequeño; es fácil de perturbar las células con la punta de una pipeta o un fuerte flujo de aire de un aspirador. </li><li> Mezclar las partículas marcadas con fluorescencia con un medio de cultivo celular (preparado como se ha descrito anteriormente). Añadir Candida -BFP (a una MOI de 10), con fluorescencia perlas-conejo-zymosan conjugado o látex IgG-FITC (10 partículas por célula) a las células. Utilizar un volumen final de 200 l medios de comunicación para una cámara bien para asegurar que todas las células están cubiertos. </li><li> Girar por el tobogán de cámara en 277xg durante 3 min a 10 ° C. NOTA: Este paso de centrifugación ayuda a aumentar el contacto entre las partículas y las células, y se sincroniza el proceso de unión. </li><li> Transferir inmediatamente la diapositiva cámara a un incubador humidificado 37 ° C con 5% de CO2 durante 5 min. </li><li> Retire la diapositiva cámara de la incubadora y aspirar los medios de comunicación. </li><li> Se lavan las células 3 veces con PBS helado. NOTA: Compruebe la presencia de partículas sueltas con un microscopio óptico y se lava varias veces con PBS, si es necesario. Es esencial para eliminar las partículas no unidas del pozo para minimizar el ruido de fondo durante el análisis. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 500 l 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en PBS mediante incubación durante 30 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: Este paso requiere el uso de PFA al 4%, que es altamente tóxico, corrosivo, y carcinógeno potencial. Adecuada se debe tener cuidado al usar este líquido. Además, proteja las muestras de la luz. </li><li&gt; Lavar las células mediante la adición de 500 l de PBS en la cámara y aspirar la solución suavemente. </li><li> 3.1.9 Repita el paso dos veces. NOTA: En este paso, vuelva a llenar cada vial inmediatamente después de retirar el PBS anterior. </li><li> Detener la fijación mediante la incubación con 500 l de 50 mM NH 4 Cl en PBS durante 10 min. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS como se describe en el paso 3.1.10. </li><li> Permeabilizar las células mediante la adición de 250 l de tampón de unión (0,1% de saponina, 0,2% de BSA en PBS) durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Manchas F-actina mediante la adición de faloidina conjugada con fluorescencia (diluido 1: 500 en tampón de unión). Se incuban las células durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células tres veces con PBS como se describe en el paso 3.1.10. </li><li> Capturar imágenes utilizando un microscopio confocal (objetivo 63X y 402 nm y 488 nm láser) y analizar las imágenes usando ImageJ 16. NOTA: La unión Una partícula éxito se caracteriza por la presencia de un cu fagocíticap en el lugar donde el contacto de partículas de la célula fagocítica (Figura 1). Vea el paso 3.2.5. </li></ol></li><li> La fagocitosis Ensayo de absorción NOTA: Este experimento está diseñado para controlar la internalización completa de las partículas marcadas con fluorescencia por los fagocitos usando microscopía confocal (Figura 2). <ol><li> Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alternativamente, las células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 o 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de vidrio. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2. NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o una técnica similar. </li><li> Mantenga los portaobjetos de cámara (o placa) a 10 ° C durante 10 minutos. NOTA: Enfriamiento es necesario con el fin de bloquear la endocitosis, así como la fagocitosis no deseado y, posteriormente, tener un fagocitosis sincronizada. </li><li> perfORM pasos de 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> La transferencia de la diapositiva cámara a un 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2, y se incuba durante diferentes puntos de tiempo. Fijar las células después de la infección 30, 60 y 90 minutos después. Observe C. albicans se empiezan a formar hifas después de la infección de 60 minutos; fagocitos comienzan a mostrar la muerte celular (pyroptosis) después de 90 min 8. NOTA: Esta es una recomendación, y la optimización es esencial en función del tipo de células y el material en partículas utilizado. </li><li> Realice los pasos de 3.1.7 a 3.1.15. Analizar las imágenes usando ImageJ 16. NOTA: una absorción exitosa se caracteriza por una internalización completa de un material en partículas en el interior del citoplasma de un fagocito (Figura 2). La tinción de los fagocitos con marcador de superficie celular tales como faloidina ayuda a delinear el contorno de las células. También es esencial para llevar a cabo z-pilas con el fin de determinar si el material en partículas se une a la superficie celular o completely internalizado. </li></ol></li><li> Imágenes en vivo de la fagocitosis NOTA: En este protocolo se describe el uso de la microscopía confocal para capturar las diferentes etapas de la fagocitosis utilizando zymosan fluorescente conjugado. Nosotros usamos la línea de células dendríticas DC2.4 que expresa de forma estable etiquetada con mCherry F-actina 8, un biosensor que muestra la distribución de actina filamentosa en las células vivas. Desde la fagocitosis es un proceso actina impulsado por la formación de imágenes en vivo en esta celda no sólo nos permite capturar el movimiento y la dinámica de la red de F-actina, sino también para visualizar los diferentes eventos fagocíticas dentro de las células vivas (Figura 3, Película 1). <ol><li> Semillas de unos 5 x 10 4 células en un portaobjetos de cámara, a una concentración de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO 2. NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o unatécnica similar. </li><li> Mantener los portaobjetos de cámara en hielo durante 10 min. NOTA: Enfriamiento es necesario con el fin de bloquear la absorción no deseada, y tener una fagocitosis sincronizada. </li><li> Realice los pasos de 3.1.3 a 3.1.5 </li><li> Pre-calentar la platina del microscopio a 37 ° C y equilibrar la cámara con 5% de CO 2. Espere 30 a 45 min para la temperatura y el CO 2 para estabilizar antes de iniciar la formación de imágenes. NOTA: Dado que las emisiones de CO 2 y los niveles de temperatura son críticos para la fagocitosis, es importante para encender el calentador de microscopio antes del experimento para equilibrar la cámara ambiental. </li><li> Colocar el portaobjetos cámara que contiene las células en el recinto microscopio incubador equilibrado a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Realizar las imágenes en directo 17, 18. NOTA: Los ajustes de la potencia del láser (ganancia, agujero de alfiler, etc.) puede variar dependiendo del tipo de THe microscopio y la sonda fluorescente usada. Por lo tanto, se recomienda consultar el manual del microscopio para la condición óptima para su imágenes en vivo 17,18. <ol><li> Utilice microscopio láser confocal de barrido (y el software asociado) para imágenes en vivo. Utilice petróleo objetivo 63X 1.4NA con un agujero de alfiler de 1-1.1 unidades Airy. </li><li> Para iniciar la proyección de imagen, se utiliza el campo brillante para encontrar una región representativa en la diapositiva cámara. A continuación, seleccione el campo haciendo clic en la opción de posición sobre el software. Para detectar las buenas prácticas agrarias en la pista 1 utiliza el conjunto de filtros de 488 nm láser con un divisor de haz a 582 nm, para detectar longitudes de onda entre 488 y 582 nm. </li><li> En la pista 2 seleccionar un conjunto de filtros óptima para mCherry (RFP), utilizando un divisor de haz a 578 nm y la detección de longitudes de onda entre 578 y 600 nm. Utilice 488 nm y 578 nm con láseres de potencia del láser 50% y una salida de ganancia de 600-700. Obtener imágenes cada 30 seg durante un total de 90 min. </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

fagocitos profesionales, como los macrófagos y las células dendríticas, envolver y eliminar los patógenos invasores por lo tanto haciendo la fagocitosis un componente importante del sistema de defensa del huésped. Durante este proceso se someten a los fagocitos extensa reorganización de la membrana y la reorganización del citoesqueleto en su superficie celular 8, 19, 20. Para entender mejor este proceso dinámico, la vis...

A pesar de la continua exposición a patógenos tales como bacterias, virus y hongos, nuestro cuerpo está bien equipado con mecanismo inmunológico que proporciona protección frente a la infección. El sistema inmune innato es la primera línea de defensa contra los patógenos invasores y se basa principalmente en las células fagocíticas que reconocen y se internalizan objetivos extranjeros. La fagocitosis es un proceso celular evolutivamente conservada que abarca la inmersión de las partículas no deseadas de más de 0,5 micras. Las células fagocíticas expresan una amplia gama de receptores inmunes (también conocidos como receptores de reconocimiento de patrón, PRRS) en la superficie celular que les permiten reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) presentes en los patógenos antes de la inmersión 3. La unión de patógenos es seguido por la agrupación de receptores en la superficie celular y provoca la formación de una taza fagocítica. Esto da lugar a la remodelación de la membrana actina guiado que sobresale alrededorel objetivo, finalmente, que la envuelve y pellizcos-off para formar una vacuola phagosomal discreta 2, 5. El fagosoma continuación, madura y se acidifica mediante fusión posterior con los endosomas tardíos y lisosomas que forma fagolisosómica 6. Aunque se describe como la fagocitosis mediada por el receptor de eventos y actina impulsado, este proceso también se basa en la modificación espacial-temporal de los lípidos que componen la membrana de plasma, tales como fosfoinosítidos (IP) y esfingolípidos 7, 8. Mientras que la polimerización de actina es dictada por una acumulación local de fosfoinositol-4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) en la base de la copa fagocítica, despolimerización de la actina depende de la conversión de (PI (4,5) P 2 a fosfoinositol-3,4,5-bifosfato (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Ambas modificacionesson esenciales ya que el primero lleva a la extensión de los seudópodos alrededor del objetivo y éste permite el hundimiento de las partículas en el citosol de la fagocitos 10. Las células que tienen la capacidad de fagocitar o son fagocitos profesionales, como macrófagos / monocitos, granulocitos / neutrófilos, y células dendríticas (DC) o fagocitos no profesionales, tales como fibroblastos y células epiteliales 11. La fagocitosis realizada por todos los fagocitos juega un papel central en el mantenimiento del tejido y remodelación, mientras que la fagocitosis realizada por fagocitos profesionales se encarga de la coordinación de la respuesta inmune innata y adaptativa frente a los patógenos. fagocitos profesionales no sólo engullen y matan el patógeno, sino también los antígenos presentes en las células linfoides del sistema inmune adaptativo. Esto contribuye a la liberación de citoquinas pro-inflamatorias y para la participación de las células linfoides, por lo tanto, conduce ael bloqueo con éxito de la infección 12. técnicas bioquímicas convencionales han sido fundamentales en la obtención de conocimientos sobre el mecanismo molecular de diferentes procesos celulares durante la fagocitosis, tales como las modificaciones posteriores a la traducción y diversas asociaciones de alta afinidad entre proteínas. Sin embargo, es difícil obtener información con respecto a la dinámica espacial y temporal de los acontecimientos fagocíticas utilizando los métodos bioquímicos convencionales. imágenes de células vivas no sólo nos permite supervisar eventos celulares en cuenta la sensibilidad de tiempo sino que también nos permite obtener información a nivel de células individuales. Aquí se describe un método para investigar las diferentes etapas de la fagocitosis, así como analizar todo el proceso espaciotemporalmente usando microscopía confocal.

<table><tbody><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&amp;rsquo;s Minimal Eagle&amp;rsquo;s medium)</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>FITC-coupled IgG-coated latex beads</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122&quot;&gt;15-140-122&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264.7 cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>&amp;nbsp;85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Glasstic slide 10 with grids</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing the early stages of phagocytosis

El cuerpo de los mamíferos está equipado con varias capas de mecanismos que ayudan a defenderse de las invasiones de patógenos. Fagocitos profesionales del sistema inmune - como los neutrófilos, células dendríticas y macrófagos - conservan la capacidad innata para detectar y borrar dichos patógenos invasores a través de la fagocitosis 1. La fagocitosis implica eventos coreografía de reorganización de la membrana y la remodelación de la actina en la superficie celular 2, 3. Los fagocitos interiorizan con éxito y erradicar moléculas extrañas que se hayan cumplido todas las etapas de la fagocitosis. Estos pasos incluyen reconocimiento y unión del patógeno por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que reside en la superficie celular, la formación de la taza de fagocitosis a través de protuberancias membranosas de actina enriquecido (seudópodos) para rodear el material en partículas, y la escisión del fagosoma, seguido de maduración fagolisosoma que resultados en lamatando del patógeno 3, 4. Imaging y cuantificación de las diversas etapas de la fagocitosis es instrumental para elucidar los mecanismos moleculares de este proceso celular. El presente trabajo reporta métodos para estudiar las diferentes fases de la fagocitosis. Se describe un enfoque basado en microscopio para visualizar y cuantificar la formación de una copa de unión, fagocítica, y la internalización de partículas por los fagocitos. Como la fagocitosis se produce cuando los receptores innatas en las células fagocíticas encuentran ligandos sobre una partícula objetivo más grande que 0,5 m, los ensayos que aquí presentamos comprender el uso de hongos patógenos Candida albicans y otras partículas tales como zymosan y perlas recubiertas con IgG.

se presenta método basado en microscopio para controlar las diferentes etapas de la fagocitosis. Se muestran los diferentes eventos durante la fagocitosis de partículas fluorescentes diferentes de células DC2.4. Usando las técnicas descritas aquí, se investigó el papel de los esfingolípidos en las primeras etapas de la fagocitosis. Para este propósito, las células dendríticas DC2.4 genéticamente deficientes en Sptlc2, la enzima que cataliza la primera y la tasa de limitación de paso en la ruta de biosíntesi...

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Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K vistas.  Oregon Health & Science University. Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Video: Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Imágenes de la Neutrófilos Fagosoma y el citoplasma usando un indicador de pH Ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.

Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics have been at the forefront. They interact with and regulate immune cell activity. The focus of this study is the MSC regulation of macrophage phagocytic activity. Macrophage (M&#934;) phagocytosis is an important part of the innate immune system response to infection, and the mechanisms through which MSC modulate this response are under active investigation. Presented here is a method to study M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan particles conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule while in co-culture with MSC. As phagocytic activity increases and the labeled zymosan particles are enclosed within the acidic environment of the phagolysosome, the fluorescence intensity of the pH-sensitive molecule increases. With the appropriate excitation and emission wavelengths, phagocytic activity is measured using a fluorescent spectrophotometer and kinetic data is presented as changes in relative fluorescent units over a 70 min period. To support this quantitative data, the change in the phagocytic activity is visualized using dynamic imaging. Results using this method demonstrate that when in co-culture, MSC enhance M&#934; phagocytosis of non-opsonized zymosan of both naive and IFN-&#947; treated M&#934;. These data add to the current knowledge of MSC regulation of the innate immune system. This method can be applied in future investigations to fully delineate the underlying cellular and molecular mechanisms.

Presented here is a protocol to quantify and produce dynamic images of mesenchymal stem cell (MSC) mediated regulation of macrophage (M&#934;) phagocytosis of non-opsonized yeast (zymosan) particles that are conjugated to a pH-sensitive fluorescent molecule.

Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

Source: Horsthemke, M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57566">Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

Imágenes en tiempo real de la fagocitosis de macrófagos de glóbulos rojos opsonizados con IgG

Source: Horsthemke, M., et al. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor ...