El financiamiento fue proporcionado por el USDA CRIS 5347-22620-021-00D y, en parte, por la Agricultura y la Alimentación de Investigación Iniciativa Competitiva subvención no. 2011-67009-30141 del Instituto Nacional del USDA de la Agricultura y la Alimentación. Estamos muy agradecidos por el apoyo técnico de Johanna Nassif. También queremos agradecer a Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, y Frances Sivakoff para proporcionar algunas de las imágenes utilizadas en la Figura 3.

1. Marque Interna, Retención y Procedimiento de Detección <ol><li> Procedimiento de marcación interna <ol><li> Recoge los insectos de interés (n ≈ 100 individuos) de una colonia de laboratorio criados con una dieta artificial o desde el campo y se dividen en dos contenedores de cría limpias. </li><li> Coloque un paquete regular de 20 ml de dieta (tratamiento control negativo sin marcar) en uno de los contenedores. Suplemento de un segundo paquete de 20 ml artificial dieta con 1,0 ml de una solución de 1,0 mg / ml de IgG de pollo / IgY, mezclar bien, y colocarlo en otro recipiente. Nota: Si el insecto de interés no tiene una dieta artificial, la marca se puede colocar sobre o en cualquiera que sea la dieta que normalmente se mantienen en (por ejemplo, judías verdes, huevos de la polilla, el agua, el azúcar, la miel). </li><li> Permitir a los insectos para reanudar su actividad de alimentación durante 24 horas. </li></ol></li><li> Procedimiento de retención de marca interna <ol><li> Retire los paquetes de la dieta de cada contenedor y suministrar los insectos wITH otra fuente de alimento para sostenerlos durante la duración del experimento (por ejemplo, judías verdes). </li><li> Recoger una cohorte (n = 20) de los insectos diariamente (o en cualquier intervalo de tiempo deseado) de cada tratamiento y congelar inmediatamente a -20 ° C. </li></ol></li><li> Sandwich procedimiento ELISA <ol><li> Añadir 50 l de conejo anti-pollo IgY anticuerpo primario diluido 1: 500 en solución salina amortiguadora Tris (TBS) a cada pocillo de una microplaca de ELISA limpia e incubar durante un mínimo de 1 hora a RT (nota: las microplacas también se pueden incubar O / N a 4 ° C). </li><li> Desechar el anticuerpo de la placa y bloquear cada pocillo con 300 l de una solución de leche seca no grasa 1,0% durante 30 min. </li><li> A la espera de los pasos de incubación anteriores, colocar insectos congelados individualmente en 1,6 ml tubos de microcentrífuga con 1,0 ml de TBS. </li><li> Moler cada insecto con una mano limpia hasta que se homogeneizó a fondo y añadir 100 l de cada muestra a un pocillo individual de la prueba ELISAplato. Permitir que las muestras se incuban a temperatura ambiente a durante 1 h. </li><li> Añadir 100 l de negativo (TBS solamente) y positivos (claras de huevo en TBS) controles a pozos en la primera columna de cada placa de ELISA. Además, añadir 100 l de controles negativos de insectos (insectos sin marcar) a los 8 pozos en la última columna de cada placa (Figura 1). Permitir que las muestras de control incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Tenga en cuenta que la plantilla proporcionada en la Figura 1 es la plantilla que utilizamos para nuestros ensayos estandarizados. La colocación de las muestras en los pocillos es a la discreción del investigador. </li><li> Lavar cada pocillo tres veces con tampón fosfato salino (PBS) Tween y luego añadir 50 l de IgG de conejo anti-pollo / IgY conjugado con peroxidasa de rábano picante diluida 1: 10.000 en solución de leche 1% y se incuba durante 1 hora a RT. </li><li> Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y añadir 50 l de tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo. </li><li> Después de 10 min, leer los pozoscon un espectrofotómetro de microplacas ajustado a una longitud de onda de 650 nm. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> Figura 1. Un diagrama esquemático que muestra las designaciones así estandarizados utilizados para una típica de 96 pocillos ELISA microplaca. Cada placa contiene 7 pozos dedicados a controles negativos de solución salina tamponada con Tris (TBS), un pozo dedicados a un control de la proteína positivo (Pos Ctrl), 80 pozos individuales dedicadas a insectos recapturados (muestra 1 ... 80), y 8 pozos dedicados a controles sin marcar (negativos) de insectos (Neg Ctrl 1 ... 8). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2. Marque externa, Retención y Procedimiento de Detección <ol><li> Procedimiento de marcado externo <ol><li> Recoge los insectos de interés (n ≈ 100individuos) de una colonia de laboratorio o de campo y el lugar en dos recipientes de plástico 1.0 L con un agujero de 2,5 cm de diámetro perforados por el lado de cada contenedor. </li><li> Pulverizar los insectos en el primer recipiente con 1,0 ml de dH 2 O (tratamiento control negativo) utilizando un nebulizador médico. Pulverizar los insectos en el segundo recipiente con 1,0 ml de una solución 5,0% de claras de huevo de pollo usando un nebulizador médico. </li><li> Conecte la manguera del nebulizador a una toma de aire estándar de laboratorio y luego insertar la desembocadura del nebulizador en el agujero de 2,5 cm del recipiente. A continuación, encienda la salida de aire gradualmente hasta que el nebulizador produce un vapor. </li><li> Continuar pulverización (marcado) hasta que la solución claras de huevo se ha dispensado (aprox. 2-5 minutos). </li><li> Retire el nebulizador y colocar un tapón en el orificio del recipiente de plástico. Permita que los insectos que están a temperatura ambiente hasta que la solución se haya secado completamente. </li></ol></li><li> Procedimiento de retención de marca externa<ol><li> Coloque cada tratamiento de los insectos secos en un recipiente de cría limpia separada para evitar una mayor exposición a la marca. </li><li> Añadir alimentos y agua a los recipientes limpios para sostener los insectos durante la duración del estudio. </li><li> Recoge una cohorte (n = 20) de los insectos de cada tratamiento diario y congelar inmediatamente a -20 ° C. </li></ol></li><li> Procedimiento ELISA indirecto <ol><li> Coloque los insectos congelados individualmente en tubos de microcentrífuga de 1,6 ml y añadir 1,0 ml de TBS. </li><li> Remoje las muestras durante 1 hora en un conjunto agitador orbital a 120 rpm. </li><li> Añadir controles positivos y negativos como se describe en el Paso 1.3.5. </li><li> Después de remojar, pipetear una parte alícuota de 100 l de cada muestra en uno de los 80 pocillos de muestras designadas en una nueva placa de ELISA de 96 como se muestra en la Figura 1 Permitir que las muestras se incuban durante 1 hora a RT (nota:. Las microplacas También puede haber O incubado / N a 4 ° C). </li><li> Lavar éstos tres veces conPBS-Tween y luego añadir 300 l de fosfato salino tamponada que contiene 1% de albúmina de suero bovino (PBS-BSA) a cada pocillo. </li><li> Después de 30 min a TA lavar dos veces con PBS-Tween. </li><li> Añadir 50 l de conejo anti-albúmina de huevo anticuerpo primario diluido 1: 8000 en PBS-BSA-Silwet (0,05%) a cada pocillo e incubar durante 1 hora a RT. </li><li> Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y luego añadir 50 l de IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano diluida 1: 2000 en PBS-BSA-Silwet (0,05%) durante 1 hora a RT. </li><li> Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y se añaden 50 l de sustrato TMB a cada pocillo. </li><li> Después de 10 min, leer los pocillos con un espectrofotómetro de microplacas ajustado a una longitud de onda de 650 nm. </li></ol></li></ol> Análisis 3. Datos <ol><li> Calcular el valor medio de absorbancia de los insectos de control negativo 8 en cada placa ELISA y luego calcular la desviación estándar a partir de los controles negativos agrupados lado a otrom todas las placas de ELISA de un estudio dado 12. </li><li> Añadir seis veces la desviación estándar combinada con la media obtenida para cada placa ELISA para obtener un valor umbral positivo ELISA. Cualquier muestra de insectos obteniéndose un valor de absorbancia igual o mayor que este valor se considera que es positivo para la presencia de la marca de la proteína. </li></ol>

La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación ni aprobación por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos. USDA es un proveedor de igualdad de oportunidades.

El procedimiento inmunomarcaje proteína artrópodos fue descrita por primera vez casi un cuarto de siglo atrás 9. Desde entonces, el procedimiento se ha adaptado para estudiar los patrones de dispersión de una amplia variedad de artrópodos utilizando administrados tanto interna como externamente IgG / IgY. Estas proteínas han demostrado marcadores firmes para la amplia variedad de especies de insectos ensayadas hasta el momento. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la principal limitación para ...

Seguimiento de los movimientos de plagas de artrópodos, enemigos naturales (parasitoides y depredadores), y polinizadores en la naturaleza es esencial para comprender mejor la manera de mejorar los servicios de los ecosistemas. El componente clave para la mayoría de tipos de investigación dispersión está teniendo un método fiable para etiquetar el artrópodo (s) de interés. Una variedad de materiales (por ejemplo, pinturas, tintes, polvos de colores, etiquetas, elementos raros, proteínas) se han utilizado para marcar los artrópodos para evaluar su dinámica poblacional, la capacidad de dispersión, la alimentación de comportamientos y otras interacciones ecológicas 1,2. La idoneidad de un marcador utilizado para cualquier investigación dispersión dada dependerá del tipo de estudio que se llevó a cabo. Hay tres grandes categorizaciones para marcar artrópodos: (1) la marca de liberación y recaptura (MRR), (2) la marca de captura, y (3) la auto-marca-de captura. Para la investigación signo de liberación y recaptura, el investigador normalmente marca los artrópodos colectivamente en el Laboratory y los libera en un punto central en el campo. Los artrópodos son luego recapturados en distintos intervalos espaciales y temporales utilizando diferentes dispositivos de recogida (por ejemplo, la red de barrido, vacío, trampa pegajosa) 3,4,5. Los ejemplares recapturados se examinan a continuación, para la marca específica para distinguir liberado de personas nativas. Para la investigación marca de captura, el investigador normalmente se aplica la marca directamente en el equipo de aspersión campo utilizando (por ejemplo, pulverizador de mochila, la pluma y el pulverizador de boquilla). Los mejores marcadores para la investigación marca de captura son de bajo costo y de fácil aplicación para el hábitat de los artrópodos. Para la investigación propia marca de captura, el investigador suele aplicar marcas a un cebo artrópodos 6,7 o nido de entrada 8. A su vez, el artrópodo marca internamente devorando el cebo marcado o externamente por &quot;cepillado&quot; en contra de la marca a medida que sale del nido. Como se mencionó anteriormente, muchos tipos de marcadores nos han sidoed para etiquetar una variedad de especies de artrópodos. Sin embargo, muy pocos son útiles para estas tres categorías de investigación de dispersión. El desarrollo del procedimiento inmunomarcaje proteína fue un gran avance para el marcado de los insectos. Inmunomarcaje pone una etiqueta de proteínas en los artrópodos, ya sea interna o externamente, que, a su vez, se detecta mediante un ensayo anti-proteína específica inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Los primeros marcadores tales proteínas utilizadas fueron inmunoglobulina de conejo (IgG) y pollo IgG / IgY 9,10. Demostraron ser marcas muy eficaces para MRR y la investigación propia marca de captura (véase el debate). Por desgracia, las proteínas de IgG / IgY son costosos y por lo tanto no son prácticos para la investigación mark-captura y la mayoría de los tipos de investigación propia marca de captura. Posteriormente, los ELISA de detección de proteínas de segunda generación fueron desarrollados para las proteínas contenidas en la clara de huevo de pollo (albúmina), la leche de vaca (caseína) y la leche de soja (proteína inhibidora de tripsina). Cada ensayo es muy sensible, específico, y, lo másimportante, utiliza las proteínas que son mucho menos costosas que las proteínas de IgG / 11 IgY. Estas proteínas han demostrado ser eficaces para el MRR, marca de captura, y la investigación propia marca de captura (véase el debate). En este artículo, describimos y demostramos cómo llevar a cabo estudios de retención de laboratorio marca proteína. Tales estudios son la primera fase de la investigación necesaria para cualquier tipo de estudio de campo de dispersión. En concreto, es fundamental que los investigadores saben cuánto tiempo se mantendrá la marca en las especies de artrópodos dirigidos antes de embarcarse en estudios de campo de dispersión. A continuación, describimos y demostramos cómo marcar interna y externamente insectos para MRR, marca de captura, y estudios de campo de tipo auto-marca-de captura. A continuación, mostramos la forma de detectar la presencia de las marcas con los ELISA indirectos y sándwich.

<table><tbody><tr><td>Food storage container (for insect rearing)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Various sizes</td><td>Various manufacturers &amp;amp; vendors. Mesh fabric is glued in a window</td></tr><tr><td>Small volume nebulizer (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.</td></tr><tr><td>Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>This design is nice because it doesn&#039;t crowd the tubes.</td></tr><tr><td>Dispenser, repeater</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Anything similar will help speed up the dispensing.</td></tr><tr><td>Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation pipette, manual (20-200 &amp;micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200 or 1070-0200</td><td>Any similar type will work. This model is ergonomic.</td></tr><tr><td>Reservoirs, sterile reagent</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>If you had to pick one electronic model, this size is most useful.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (10-300 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&amp;nbsp;</td><td>Anything similar will work for manual plate washing.</td></tr><tr><td>Microplate reader with absorbance detection</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Chicken IgG/IgY</td><td>United States Biological</td><td>I1903-15R</td><td>Also available from other sources</td></tr><tr><td>Egg whites</td><td>Grocery store</td><td>&amp;ldquo;All Whites&amp;rdquo;, &amp;ldquo;Egg Beaters&amp;rdquo;, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td><td>Mix 5 ml with 95 ml dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 5% solution</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g/L to make TBS</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g/L to make TBS and 8.0&amp;nbsp;g&amp;#8288;/&amp;#8288;L for PBS</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, EIA grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.</td></tr><tr><td>PBS with 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 packet in 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 50 ml TBS</td></tr><tr><td>Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%)</td><td>Grocery store</td><td></td><td>Mix 10 g with 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 1% solution</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 1 L of 1% milk</td></tr><tr><td>Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Dilute 125 &amp;micro;l in 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3&amp;nbsp;ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Add as last ingredient</td></tr><tr><td>TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research

Monitoreo movimiento artrópodos se requiere a menudo para comprender mejor la dinámica de población asociados, patrones de dispersión, las preferencias de la planta huésped, y otras interacciones ecológicas. Los artrópodos suelen ser rastreados en la naturaleza mediante el etiquetado con una marca única y luego vuelven a su recogida en el tiempo y en el espacio para determinar sus capacidades de dispersión. Además de las etiquetas físicas reales, como el polvo o pintura de color, varios tipos de proteínas han demostrado ser muy eficaz para el marcado de los artrópodos para la investigación ecológica. Las proteínas se pueden administrar internamente y / o externamente. Las proteínas pueden entonces ser detectados en los artrópodos recapturados con un ensayo ligado a enzimas específico de la proteína de inmunoabsorción (ELISA). Aquí se describen los protocolos para la externa como internamente etiquetado artrópodos con la proteína. Dos ejemplos experimentales sencillos se demuestran: (1) una marca de proteína interna presenten a un insecto, proporcionando una dieta enriquecida con proteínas y (2) una marca de proteína externa tópicamente unpplied a un insecto usando un nebulizador médico. A continuación relacionamos una guía paso a paso del sándwich y métodos indirectos de ELISA utilizados para detectar signos de proteínas en los insectos. En esta demostración, se discuten diversos aspectos de la adquisición y la detección de marcadores de proteínas en los artrópodos para la marca de liberación y recaptura, marca de captura, y los tipos de auto-marca-captura de la investigación, junto con las diversas formas en que el procedimiento inmunomarcaje ha sido adaptado para adaptarse a una amplia variedad de objetivos de investigación.

Marcado interno: Los resultados de la prueba de retención marca interna se muestran en la Figura 2A. El valor umbral crítico ELISA calculado era 0.054. En general (en todas las cuatro fechas muestra combinada), los insectos tratados sin proteínas dieron valores constantemente bajos de ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Por el contrario, todos los insectos alimentados con la dieta ...

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Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Administrar y Detección de Marcas de proteínas de Artrópodos de Dispersión de Investigación

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

administering-detecting-protein-marks-on-arthropods-for-dispersal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

7.3K vistas.  Arid-Land Agricultural Research Center. Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated. 

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A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Un ensayo de bioluminiscencia de calcio para el análisis funcional de los Mosquitos ( Aedes aegypti) Y Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados a proteínas

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Investigación

Inmunología e Infección

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Preparación a mediano plazo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embriones para experimentos proteómicos

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Biología del Desarrollo

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

Un método rápido y eficiente para disecar alas Pupal de Drosophila apto para Immunodetections o ensayos PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Disección de los músculos de vuelo de Drosophila melanogaster para los enfoques de Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genética

A Method for Quantifying Foliage-Dwelling Arthropods

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density requires a method with high detection probability and a known sampling area. While most described methods provide a qualitative or semi-quantitative estimate adequate for describing species presence, richness, and diversity, few provide an adequately consistent detection probability and known or consistent sampling areas to provide an index or estimate with adequate precision to detect differences in abundance across environmental, spatial, or temporal variables. We describe how to quantify leaf-dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate and quantify them. As we demonstrate, this method can be used at a landscape scale to quantify leaf-dwelling arthropods with adequate precision to test for and describe how spatial, temporal, environmental, and ecological variables influence arthropod richness and abundance. This method allowed us to detect differences in density, richness, and diversity of leaf-dwelling arthropods among 5 genera of trees commonly found in southeastern deciduous forests.

We describe how to quantify leaf dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate for quantification.

Un método para cuantificar artrópodos que habitan en el follaje

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density ...

Medio ambiente

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

La medición de las respuestas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas Uso de Imagen de calcio en Vivo

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

SwarmSight: Seguimiento en tiempo real de movimientos de insecto de antena y reflejo de extensión probóscide utilizando una preparación común y Hardware convencional

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

Neurociencias

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the mode of action (MOA) of such molecules leverage bulk treatment of experimental specimens with an excess of a specific reactive species. In this approach, the high reactivity of electrophiles renders non-discriminate labeling of the proteome in a time- and context-dependent manner; redox-sensitive proteins and processes can also be indirectly and often irreversibly affected. Against such a backdrop of innumerable potential targets and indirect secondary effects, linking phenotype to specific target engagement remains a complex task. Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX)-an on-demand reactive-electrophile delivery platform adapted for use in larval zebrafish-is designed to deliver electrophiles to a specific protein of interest (POI) in otherwise unperturbed live fish embryos. Key features of this technique include a low level of invasiveness, along with dosage-, chemotype-, and spatiotemporally-controlled precision electrophile delivery. Thus, in conjunction with a unique suite of controls, this technique sidesteps off-target effects and systemic toxicity, otherwise observed following uncontrolled bulk exposure of animals to reactive electrophiles and pleiotropic electrophilic drugs. Leveraging Z-REX, researchers can establish a foothold in the understanding of how individual stress responses and signaling outputs are altered as a result of specific reactive ligand engagement with a specific POI, under near-physiologic conditions in intact living animals.

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) is a chemical biology-based method for the investigation of reactive small-molecule signaling. This technique can be applied to live fish of different developmental stages. Here, we couple standard assays in zebrafish with Z-REX for signaling pathway analysis.

Monitoreo de respuestas de señalización en el objetivo en larvas de pez cebra - Z-REX desenmascara mecanismos precisos de fármacos electrofílicos y metabolitos

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

Biología

<meta charset="utf8"></head><body>Imágenes de alta resolución y análisis de defectos oculares de Drosophila

A Rapid, Simple Workflow for Quantification of External Adult Drosophila Structures

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It is a simple structure of repeating unit eyes, termed ommatidia, that is used to characterize genetic interactions and gene functions. Mutations that affect eye architecture can be easily detected and analyzed; hence, this system is frequently used in under-resourced institutions. Further phenotypic analysis often includes a Scanning Electron Microscope (SEM) to generate high-magnification images suitable for quantitative analysis. However, SEMs are expensive and require costly reagents; sample preparation spans days; and, often, they need full-time staff for sample preparation and instrument maintenance. This limits their utility at under-resourced institutions or during budgetary austerity. In entomology, the use of high-resolution digital imaging technology is a common practice for the identification and characterization of species. This paper describes a method that combines strategies and allows for high-resolution digital imaging of adult Drosophila structures and quantitative analysis using the open software ImageJ. The workflow is a rapid and student-friendly alternative that remedies the limitations of underfunded and under-resourced research facilities with a cost-effective and rapid approach to quantitative phenotypic analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>Un flujo de trabajo rápido y sencillo para la cuantificación de estructuras externas de Drosophila adulta

Here, we present a rapid, low-cost, workflow for high-resolution imaging of adult Drosophila eyes to quantify patterning and growth defects. We describe our protocol for sample preparation by point-mounting, high-resolution image acquisition, and image analysis.

Un flujo de trabajo rápido y sencillo para la cuantificación de estructuras externas de Drosophila adulta

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It ...

Administrar y Detección de Marcas de proteínas de Artrópodos de Dispersión de Investigación

Resumen

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Capítulos en este video

Un ensayo de bioluminiscencia de calcio para el análisis funcional de los Mosquitos ( Aedes aegypti) Y Tick ( Rhipicephalus microplus) G receptores acoplados a proteínas

Preparación a mediano plazo de

Un método rápido y eficiente para disecar alas Pupal de Drosophila apto para Immunodetections o ensayos PCR

Disección de los músculos de vuelo de Drosophila melanogaster para los enfoques de Omics

Un método para cuantificar artrópodos que habitan en el follaje

La medición de las respuestas fisiológicas de

SwarmSight: Seguimiento en tiempo real de movimientos de insecto de antena y reflejo de extensión probóscide utilizando una preparación común y Hardware convencional

Monitoreo de respuestas de señalización en el objetivo en larvas de pez cebra - Z-REX desenmascara mecanismos precisos de fármacos electrofílicos y metabolitos

Un flujo de trabajo rápido y sencillo para la cuantificación de estructuras externas de Drosophila adulta

Un flujo de trabajo rápido y sencillo para la cuantificación de estructuras externas de Drosophila adulta