The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

1. Preparación de polimérica acuosa sistema de dos fases (ATPS) <ol><li> Pesar 0,5 g de polietilenglicol (PEG) (MW: 35.000) y añadirlo a 9,5 ml de medio de crecimiento completo en un cónica 15 ml estéril para preparar 10 ml de 5% (w / v) PEG fase acuosa. Nota: Adición de la mitad del medio a la cónica primero seguido de la adición del polímero y luego la cantidad restante de medio minimiza la adhesión del polímero a las paredes cónicas y ayuda a que el polímero se disuelve más rápido. </li><li> Pesar 0,128 g de dextrano (DEX) (MW: 500.000) y añadirlo a 0,872 ml de medio de crecimiento completo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril para preparar 1 ml de 12,8% (w / v) de fase acuosa DEX. </li><li> Vortex tanto soluciones durante aproximadamente 1 min para disolver los polímeros en el medio. </li><li> Mantenga ambas soluciones en un baño de agua a 37 ° C durante 1 hora para asegurar la disolución y mezclas homogéneas. Mantenga las tapas por encima del nivel del agua para evitar la posibilidad de contaminación de las soluciones del bañoagua. </li><li> Cargar la solución de fase de PEG en una jeringa de plástico estéril y pasarlo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras de tamaño de poro para eliminar las impurezas. Nota: llene la jeringa con la solución de PEG, colocarlo en el inserto del filtro en la parte superior de un tubo cónico y el uso de la fuerza, empuje lentamente la solución a través del filtro. Es normal experimentar la resistencia contra el movimiento del émbolo de la jeringa. Pérdida menor de la solución de polímero se produce como parte de la solución permanecerá en el filtro, pero la concentración de polímero no va a cambiar. </li><li> Pipetear 10 l de la solución de fase DEX y diluir en 10 l de medio en un tubo separado para dar lugar a 6,4% (w / v) solución de fase DEX. Aspirar 100 l de la solución de fase de PEG y dispensar en una placa de Petri. <ol><li> Dispensar 0,5 l de la 6,4% (w / v) solución de fase de DEX en la solución de fase de PEG. Confirmar visualmente con éxito la formación de ATPS mediante la observación de una gota DEX bajo un microscopio. El límite gotadebe permanecer visible, indicando la presencia de dos fases acuosas estables, separadas. </li></ol></li><li> Almacenar la madre acuosa PEG y soluciones de fase de DEX en 4 ° C hasta su uso. Nota: Se recomienda que las soluciones de polímero se preparan fresco antes de cada experimento y se usan dentro de las 24 horas de almacenamiento. </li></ol> 2. Preparación para la impresión de cáncer esferoides celulares <ol><li> Se cultivan las células de cáncer de interés (por ejemplo, células MDA-MB-157 de cáncer de mama) a un 90% -100% monocapa confluente. Para MDA-MB-157 células, utilizar un medio compuesto por DMEM que contenía 10% de FBS, 1% de glutamina, y 1% de antibiótico. <ol><li> Cosecha células utilizando un tampón de disociación celular (de acuerdo con el protocolo del fabricante) y cargar la suspensión en una cónica 15 ml. Centrifugar durante 5 min a 173,3 xg, eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de medio de crecimiento completo. </li></ol></li><li> Las celdas de carga en un hemocitómetro y contarlas para calcular el número requeridode células para una densidad celular esferoide deseado. Una monocapa confluente de células MDA-MB-157 células cultivadas en un matraz T75 generalmente da ~ 7 x 10 6 células. Nota:. Densidad celular requerida para un volumen de gota para generar un solo esferoide dependerá del tipo de célula 22 Por ejemplo, una densidad de 1,5 x 10 4 o mayor para la MDA-MB-157 células se recomienda por 0,3 l gota fase de DEX a asegurar la formación de un solo esferoide. </li><li> Centrifugar las células para una segunda vez durante 5 min a 173,3 xg y resuspender en un volumen apropiado de medio de crecimiento para concentrar la suspensión a una densidad celular deseada. Nota: Por ejemplo, si se cosecharon 7 x 10 6 células cancerosas, el volumen total de suspensión de células requerido para formar un esferoide de la densidad de 1,5 x 10 4 células en una gota de fase DEX 0,3 l será 140 l. Sin embargo debido a la dilución con la solución de fase DEX en el siguiente paso, sólo utilizar 70 l de medio de cultivo celular para resuspender las células. </li><li&gt; Añadir a la suspensión de células resultante un volumen igual de la 12,8% (w / v) solución de fase acuosa preparada en la DEX 1.2. Para el ejemplo de esferoide densidad de 1,5 x 10 4 células, 70 l de la solución de fase DEX se añaden a 70 l de suspensión celular. </li><li> Mezclar bien la suspensión de células para asegurar una distribución uniforme de células y la mezcla de solución de DEX. Pipeteado arriba y abajo deben hacerse con cuidado para evitar la formación de burbujas. </li></ol> 3. Preparación para la impresión de los esferoides cocultivaron <ol><li> Se cultivan las células de cáncer (por ejemplo, MDA-MB-157 células de cáncer de mama humano) y células de apoyo (por ejemplo, fibroblastos humanos) a un 90% -100% monocapa confluente. Cosecha de cada tipo de células usando un tampón de disociación celular (de acuerdo con el protocolo del fabricante). <ol><li> Cargar cada suspensión en un cónica 15 ml, centrifugar durante 5 min a 173,3 xg, y el sobrenadante aspirado de cada cónica. Resuspender las células de cada cónica en 1 ml de g completamedio recimiento. Nota: Los tintes fluorescentes tales como calceína AM (tinción de células vivas) y colorantes nucleares (Hoechst) se pueden utilizar para distinguir los dos tipos de células. </li></ol></li><li> Cargar cada tipo de célula por separado en un hemocitómetro y contarlas para calcular el número requerido de cada tipo de célula para una relación deseada de las células de cáncer de células de soporte en co-cultivadas esferoides. Monocapas confluentes de células MDA-MB-157 células y los fibroblastos cultivados en matraces T75 suelen dar ~ 7 x 10 ~ 6 y 6 x 10 6 células, respectivamente. </li><li> Añadir el volumen correcto de la suspensión de células de sostén a las células cancerosas suspensión para dar una relación deseada de la cantidad de dos tipos de células. Por ejemplo, utilizar una proporción de 50 células cancerosas a 1 celular de fibroblastos. </li><li> Centrifugar la cónica que contiene la suspensión celular se mezcló durante 5 min a 173,3 células XG y resuspender en un volumen apropiado para dar como resultado la densidad final que comprende de volúmenes iguales de medio de crecimiento y el 12,8% (w / v) DEX acuosasolución de fase (preparado en 1.2). </li><li> Pipetear suavemente la suspensión celular resultante de arriba a abajo para asegurar la homogeneidad de la suspensión. </li></ol> 4. Impresión de esferoides tumorales en una placa de 96 pocillos <ol><li> Un día antes de los experimentos, recubrir placas no tratadas, de fondo redondo de 96 pocillos con 1% (w / v) Pluronic a 37 ° C durante 24 hr. Este recubrimiento evita la unión de células durante el período de cultivo. </li><li> Dispensar 50 l de la filtró 5% (w / v) PEG fase acuosa en cada pocillo de una (placa de destino) placa de 96 pocillos. </li><li> Con una pipeta, mezclar la suspensión celular (preparado en el paso 2 o el paso 3 de los mono y co-cultivo, respectivamente) y añadir 20 l de la suspensión de todos los demás bien de una columna de una placa de 384 pocillos (placa de fuente) . </li><li> Encienda el manipulador de líquidos y &quot;casa&quot; la cabeza de pipeteado para registrar las coordenadas. A continuación, compile un protocolo previamente definido (por debajo de 4,6) para asegurar el material de laboratorio y los parámetros se definen correctaly. Este paso &quot;homing&quot; puede ser diferente para diferentes manejadores de líquidos. Nota: El flujo del protocolo, se muestra paso a paso a continuación en 4.6, será similar independientemente del manipulador de líquidos robótico utilizado; Sin embargo, la interfaz de programación puede ser diferente debido a la utilización de un software diferente. </li><li> Colocar la placa fuente, la placa de destino, y las cajas de puntas de pipeta en las posiciones definidas en la estación de trabajo del manipulador de líquidos como se muestra en la Figura 1. </li><li> Ejecutar el protocolo que incluye los siguientes pasos: <ol><li> Cargar una columna de barriles de la cabeza de pipeteado del manipulador de líquidos con la mezcla de puntas de pipeta (8 tips) desde la estación de trabajo (Figura 1). </li><li> Mezclar la suspensión celular en pocillos de la placa fuente (Figura 1). Seleccionar un volumen de mezcla más pequeño que el volumen de suspensión celular en pocillos para evitar la formación de burbujas. </li><li> Expulsar puntas en una caja de vertederos vacío (Figura 1). </li&gt; <li> Cargar una columna de barriles de la cabeza de pipeteado con 10 l de dispensación puntas de pipeta (Figura 1). </li><li> Aspirar 0,3 l de la suspensión de células de la placa fuente (Figura 1) en cada punta de la pipeta. </li><li> Dispensar la suspensión de células en los pocillos de una columna de la placa de destino (Figura 1). Utilice una altura de dispensación de 0,5 mm y una velocidad de flujo de dispensación de menor que 1 l / seg. </li><li> Repetir los pasos 4.6.1 a través de 4.6.6 hasta que la impresión de la columna por columna en toda la placa de destino es completa. </li></ol></li><li> Retire con cuidado la placa de destino de la superficie de trabajo y colocarla en una incubadora húmeda a 37 ° C y 5% de CO 2. Mantener la placa horizontal al introducirla a la incubadora para evitar la interrupción de las gotas de la fase de ejecución directa que contienen células. </li><li> Incubar la placa durante 24 horas para permitir la agregación de células en un esferoide dentro de la gota fase DEX. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Tratamiento de Drogas de esferoides de células cancerosas Tenga en cuenta que el siguiente protocolo es para un tratamiento farmacológico de 4 días e incluye una renovación con el fármaco fresco después de día 2. Puede ser modificado para otros períodos de tratamiento. <ol><li> Confirmar visualmente la formación de esferoides en placas de 96 pocillos después de 24 horas. Si es necesario, pozos de imagen para la medición del tamaño de esferoides promediando los diámetros más pequeños y más grandes de cada esferoide. </li><li> Preparar la solución de stock de un fármaco deseado mediante su disolución en un disolvente recomendado por el fabricante a una concentración de solubilidad predeterminado. Por ejemplo, el cisplatino se disuelva en agua a 2 mg / ml. Nota: Proteja la solución madre de la droga de la luz si el fármaco es sensible a la luz. </li><li> Utilizando la técnica de dilución en serie, preparar concentraciones de fármaco diluido con medio de cultivo celular a partir de la solución madre preparada en la etapa anterior. Cada dilución se debe hacer dos veces la concentración deseada. Dilratios de ution variarán dependiendo de la concentración de stock de partida y concentraciones de trabajo deseada. </li><li> Añadir 50 l de solución de fármaco preparada en el paso anterior a cada pocillo. Esto se puede hacer robóticamente o mediante pipeteo manual. Nota: Cada concentración del fármaco se diluye en medio a la concentración deseada por la fase acuosa PEG 50 l ya en cada pocillo. <ol><li> Utilice esferoides de dos columnas de una placa de 96 pocillos (n = 16) para cada concentración. </li><li> En los pocillos de control, añadir sólo 50 l de medio de cultivo fresco a los 50 l de la fase acuosa PEG existentes. </li></ol></li><li> Incubar esferoides con el fármaco durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, protegido de la luz. </li><li> Después de 48 h de incubación, preparar diluciones frescas de la droga a concentraciones deseadas y renovar de drogas mediante la adición de 50 l de solución de fármaco fresco a cada pocillo. Nota: Los pozos ya contienen la concentración de fármaco deseado a partir de la primera droga tratamiento. Por lo tanto en esta fase de renovación, cada concentración se prepara a la concentración deseada, ya que no se producirá una dilución. </li><li> Incubar esferoides con el medicamento durante otras 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2, protegido de la luz. </li></ol> 6. Análisis de la viabilidad celular en esferoides <ol><li> Después de 48 horas de incubación con el fármaco renovado (es decir, el tiempo total de tratamiento de esferoides con un fármaco es 4 días), medir el volumen total de medio en un pocillo mediante pipeteo manual. Nota: El volumen típico en un pocillo es de ~ 140 l (una pequeña disminución se produce debido a la evaporación). </li><li> Calcular el volumen de reactivo de la viabilidad celular (por ejemplo, PrestoBlue) como la concentración de 10% del volumen total así. Añadir este volumen de reactivo de la viabilidad celular a cada pocillo. Nota: Con un volumen de medios de comunicación existentes de 140 l en un pozo, se requiere un volumen de 15,6 l para dar una concentración 10% del total así. Esto se calculadividiendo el volumen de medios existente por 9 (140 l / 9 = 15,6 l). </li><li> Se incuba la placa con el reactivo de la viabilidad celular a cada pocillo durante 6 horas a 37 ° C, protegido de la luz. </li><li> Colocar la placa en un lector de micro-placa y leer la señal de fluorescencia a 560 nm y 590 nm de excitación y de emisión de longitudes de onda, respectivamente. </li><li> Calcular el porcentaje de viabilidad de las células en los esferoides por la normalización de la señal fluorescente de los pocillos tratados con el de los pocillos de control después de promediar los valores de las mismas condiciones de tratamiento. </li></ol>

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Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Esferoides presentan un modelo realista para entender mejor la fisiología del tumor y la eficacia del fármaco y proporcionar una herramienta útil para el descubrimiento de fármacos anti-cáncer. Dichas aplicaciones se beneficiarían mucho de técnicas sencillas de generación y mantenimiento esferoide que sólo requieren material de laboratorio estándar, herramientas de manejo de líquidos y equipos de control. El uso de un sistema de dos fases acuosa células cancerosas espontáneamente agregados dentro de la fase...

Ensayos basados ​​en células constituyen un instrumento importante para el desarrollo y descubrimiento de nuevos fármacos contra el cáncer. 1,2 Históricamente, se han empleado cultivos monocapa de células cancerosas para investigar la eficacia de los compuestos candidatos contra determinados tipos de células cancerosas. La facilidad de mantenimiento de los cultivos en monocapa en placas de cultivo estándar, la compatibilidad de placas estándar con herramientas robóticas comerciales para la adición de reactivos, y con los equipos de control para el análisis de aguas abajo de las respuestas celulares a los compuestos químicos son los principales beneficios que hacen que las culturas 2D una herramienta atractiva para las pruebas de drogas. 3 Desafortunadamente, ensayos de células monocapa a menudo fallan para predecir la eficacia de los compuestos in vivo, por lo que el desarrollo de fármacos y el descubrimiento de un proceso extremadamente costoso. 4,5 A pesar de la inversión y el esfuerzo significativo por las compañías farmacéuticas y unidades académicas, sólo ~ 1% de lucha contra el cáncer fueron aprobados fármacos en ensayos clínicospor la FDA en los últimos dos decenios. 6 Disparidad entre las culturas en 2D y el complejo entorno 3D de células cancerosas en vivo es una de las principales deficiencias de los sistemas de cultivo en monocapa. 7 Por lo tanto, el cribado de compuestos candidatos contra las células tumorales en un entorno que se asemeja más el ambiente del tumor 3D puede acelerar el desarrollo de nuevos fármacos para quimioterapia. 8 Esferoides celulares de cáncer presentan un modelo de tumor 3D relevante in vitro. 9,10 esferoides son grupos compactos que se forman a través del conjunto espontánea o inducida de células cancerosas en las superficies no adherentes o en suspensión usando técnicas tales como matraz de centrifugación, recubrimiento líquido, micro microfabricado . bien arrays, microfluídica, y las gotas que cuelgan 11-16 esferoides imitan las características clave de los tumores sólidos, incluyendo la geometría y el transporte limitado de oxígeno, nutrientes y compuestos de la droga en la zona central; Por lo tanto, se regeneran más estrechamente respon drogasSE de tumores sólidos en comparación con los cultivos monocapa. 17-19 A pesar de esta marcado beneficio, esferoides no se utilizan habitualmente para el cribado de compuestos químicos contra las células cancerosas. Dificultad de producir esferoides de tamaño uniforme en un entorno estándar de alto rendimiento que es compatible con la robótica disponibles en el mercado y herramientas de detección / imagen impide la incorporación de la cultura esferoide en línea de desarrollo de fármacos. Aunque los materiales y las placas personalizados se han convertido recientemente disponible en el mercado para hacer frente a esta necesidad, las consideraciones de costo disuaden de su uso generalizado. Dos de las principales técnicas con la capacidad de producir esferoides tamaño consistentes en alto rendimiento de utilizar una nueva plataforma de gota colgante y micro pozos microfabricados. 13,16,20 Sin embargo, ambos enfoques requieren placas y dispositivos que son caros de fabricar e inconveniente para los usuarios de puntos finales especiales en centros de investigación básicos y las industrias farmacéuticas donde lo más importante efse hacen fuertes para el descubrimiento de nuevos fármacos contra el cáncer. A pesar de algunas mejoras en la estabilidad de las gotas que contienen células con un diseño reciente de colgar placas de caída, sólo uno de cada otro agujero de la placa todavía se utiliza durante el cultivo para evitar la propagación / fusión de gotas. 16 Esto disminuye significativamente el rendimiento experimental. Además de Drogas y la renovación es difícil con manual o pipeteo robotizado y esferoides deben ser transferidos a una placa estándar para el análisis bioquímico, porque esta configuración de la placa no es fácilmente compatible con los equipos de control convencional, tal como lectores de placas. 21 Micro-pozos fabricados utilizando litografía blanda también permitir tamaño controlado producción esferoide. 13,20 Sin embargo, la incompatibilidad de esta plataforma con herramientas de pipeteo estándar evita el tratamiento de esferoides individuales con diferentes compuestos de fármacos / concentraciones, exponiendo todos los esferoides a una sola condición de tratamiento. Por lo tanto, este método no es apropiado para altala investigación de compuestos rendimiento que exige la prueba simultánea de múltiples compuestos / concentraciones. Para superar estos obstáculos, una nueva técnica para la producción de alto rendimiento de esferoides de células de cáncer de tamaño uniforme en placas de 96 pocillos estándar ha sido desarrollado. 22,23 El enfoque se basa en un sistema acuoso polimérico de dos fases (ATPS) con polietilenglicol ( PEG) y dextrano (dex) como polímeros formadores de fase. 24 ATPSs Recientemente se han utilizado en una variedad de aplicaciones biológicas celulares nuevas que permitan micropatterning celular y localizada entrega de reactivos biológicos a las células en medios altamente acuosas. 25-32 Para formar una esferoide, las células cancerosas se mezclan con la fase acuosa DEX y una gota sub-microlitros de la suspensión resultante se pipetean en una solución de fase acuosa PEG de la inmersión pocillo que contiene. La caída sigue siendo inmiscible de la fase de inmersión y las células se limita a facilitar la formación de un esferoide. Diablilloortantly, la fase de inmersión altamente acuosa proporciona nutrientes a las células del esferoide y minimiza el problema bien conocido de la evaporación medios de comunicación común a algunos otros ensayos que causa cambios en la osmolalidad medios de comunicación y las fluctuaciones de las concentraciones de fármaco. Esta técnica permite la producción esferoide y el tratamiento de drogas sólo utilizando reactivos comercialmente disponibles y herramientas de pipeteado en placas de 96 pocillos estándar. Es importante destacar que, el análisis de las respuestas celulares de esferoides se realiza en la misma placa utilizando ensayos bioquímicos estándar y lectores de placas. La facilidad de trabajar con SDFA y adaptabilidad del enfoque para el manejo de líquidos robótico hace alta generación de rendimiento tanto de mono-cultura y la co-cultura esferoides una técnica de laboratorio sencillo. Este nuevo enfoque será un gran paso adelante hacia la integración de esferoides de células cancerosas en los procesos de desarrollo y descubrimiento de fármacos con un mejor rendimiento de las pruebas y la rentabilidad (aumento del número de compuestos y redu probadosconsumo ced reactivo) y la eficiencia (reducción de manos a tiempo). Un protocolo detallado para la producción robótico de esferoides de células de cáncer en placas de 96 pocillos utilizando el enfoque ATPS se describe a continuación. Además, se presentan los detalles del tratamiento farmacológico de esferoides resultantes y análisis de aguas abajo de respuestas celulares usando un ensayo bioquímico comercial.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents and Consumables&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol, MW: 35,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500,000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (10 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (70 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom 96-well plates</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

La estación de trabajo del manipulador de líquidos robótico se muestra en la Figura 1. La cabeza de pipeteado y todas las estaciones utilizadas en la impresión robótica de esferoides en la sección 4.6 se etiquetan. La imagen muestra el uso de dos estaciones diferentes de cajas de punta (un conjunto de consejos para la mezcla y el segundo conjunto para la aspiración / dispensación de mezcla de fase DEX-suspensión acuosa de células). Toda la instalación se encuentra en un armario estándar de s...

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Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Producción Robótica de Cancer Cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K vistas.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Video: Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor cells into neighboring tissue. Thus, invasion is a crucial step in metastasis, making the invasion process research and development of anti-metastatic drugs, highly significant. To address this demand, there is a need to develop 3D in vitro models which imitate the architecture of solid tumors and their microenvironment most closely to in vivo state on one hand, but at the same time be reproducible, robust and suitable for high yield and high content measurements. Currently, most invasion assays lean on sophisticated microfluidic technologies which are adequate for research but not for high volume drug screening. Other assays using plate-based devices with isolated individual spheroids in each well are material consuming and have low sample size per condition. The goal of the current protocol is to provide a simple and reproducible biomimetic 3D cell-based system for the analysis of invasion capacity in large populations of tumor spheroids. We developed a 3D model for invasion assay based on HMCA imaging plate for the research of tumor invasion and anti-metastatic drug discovery. This device enables the production of numerous uniform spheroids per well (high sample size per condition) surrounded by ECM components, while continuously and simultaneously observing and measuring the spheroids at single-element resolution for medium throughput screening of anti-metastatic drugs. This platform is presented here by the production of HeLa and MCF7 spheroids for exemplifying single cell and collective invasion. We compare the influence of the ECM component hyaluronic acid (HA) on the invasive capacity of collagen surrounding HeLa spheroids. Finally, we introduce Fisetin (invasion inhibitor) to HeLa spheroids and nitric oxide (NO) (invasion activator) to MCF7 spheroids. The results are analyzed by in-house software which enables semi-automatic, simple and fast analysis which facilitates multi-parameter examination.

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

A HMCA-based imaging plate is presented for invasion assay performance. This plate facilitates the formation of three-dimensional (3D) tumor spheroids and the measurement of cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). The invasion assay quantification is achieved by semi-automatic analysis.

Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

La producción de grandes cantidades de esferoides tumorales Tamaño controlados utilizando placas de micropocillos

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Bioingeniería

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

Generación de esferoides tumorales 3D para estudios de evaluación de fármacos

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

Análisis fenotípico semiautomatizado de cultivos celulares esferoides funcionales en 3D

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Bioquímica

Formación de esferoides multicelulares para análisis metabólicos y de hipoxia basados en FLIM

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

Autor destacado: Estandarización de los métodos de formación de esferoides para el análisis metabólico y de oxigenación mediante microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

Producción Robótica de Cancer Cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga

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Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares

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