NOTA: Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional Animal Vida útil Cuidado y Uso y todos los animales y los procedimientos de acuerdo con la Guía Nacional Research Council para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 10. 1. Fabricación Globo y Presión ventricular izquierda Monitoreo del Circuito <ol><li> Construya globos LV según Miller et al. 11 En un vaso de precipitados con una barra de agitación, mezcla 9,5 ml de agua destilada, 14,2 ml de jarabe de maíz de luz y 33,8 g de sacarosa, y el calor en un plato caliente, mezclar hasta que se disuelva el azúcar . Continuar solución de calefacción hasta que alcanza aproximadamente 150 ºC. NOTA: Muchos métodos existen para construir globos LV incluyendo modificación de consejos de condones y se aferran construcción de película 9,12. Nos encontramos con el método anterior sea relativamente fácil de construir globos sin fugas, sin embargo una ventaja de globos papel film incluye la caracterización previa para frequen apropiadarelaciones CY-9 de respuesta. </li><li> Romper hebras de espagueti secos en trozos de unos 5 cm de largo y sumergir un lado de cada pieza alrededor de 1 cm de profundidad en la solución de azúcar y poco a poco eliminar. </li><li> Coloque el extremo seco de la banda de pasta en un bloque de espuma de poliestireno y suspender por lo que la mezcla de azúcar gotea y forma un molde de forma de lágrima. Deja O / N en un desecador por lo que el molde se endurece. </li><li> Al día siguiente, sumergir los moldes en gel de dispersión de silicona. Coloque hebras de pasta de nuevo en bloque de espuma de poliestireno y colocar en horno aa 37 ºC durante 2 horas o hasta que se seque. Repita este paso una vez más que se aplican dos capas de silicona. </li><li> Una vez seco, el lugar en el agua durante varias horas para ayudar en la eliminación del globo del molde. Globos en tienda a la solución de azida de sodio 0,02%. </li><li> Utilice una extracción de sangre 23 G configurar para producir una cánula globo personalizado cortando una aguja para crear una punta roma y la colocación de las muescas en la aguja. </li><li> Conecte el tubo a una presión transproductor y enjuague con agua, manteniendo la tubería y cánula completamente sumergidos para evitar que entre aire en el sistema. Coloque un globo que ha sido llenado con agua sobre la cánula y el uso de suturas de seda 2-0 para atar sobre cánula. Globos de prueba por la capacidad para mantener la presión (~ 100 mmHg durante al menos 1 hora) </li></ol> 2. Preparación del sistema de perfusión aislada del corazón <ol><li> Inicialmente, lavar y calentar el sistema. Encienda un baño de agua tibia circulador 37 ºC que se ha conectado al aparato Langendorff, y rellenar depósito de regulación con agua destilada. Conecte un nuevo filtro de fibra de vidrio para tubos que desembocan en el aparato y encienda la bomba para eliminar el sistema. Durante el tiempo de preparación, controlar la temperatura del agua expulsada desde el bloque de Langendorff utilizando una sonda de temperatura, para asegurar que baño de agua se ajusta con precisión. También, encender una bomba de circulación refrigerado y se puso a 20 ºC que se utilizará durante la parada cardiopléjica del corazón. </li><li> YOn Mientras tanto preparar las siguientes soluciones. Preparar 1 l de solución de cardioplejía (NaCl 110 mM, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl 2, 10 mM NaHCO3) y el filtro. Además, preparar 2 L de KHB (NaCl 118 mM, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,7 mM MgSO 4, 2 mM Na-piruvato, dextrosa 6 mM, 24,9 mM NaHCO 3 (pre-aireada con CO 2) , 1,4 mM CaCl 2 (añadido pasado). Una vez disuelto, eliminar precipitados por filtración en un matraz de vidrio utilizando un embudo sinterizado 5 micras. Coloque un poco en un plato pequeño en hielo para ser utilizado durante la cirugía y el aislamiento. </li><li> Oxigenar el líquido de perfusión (KHB) con 95% de O2 / 5% de CO 2 durante al menos 30 min antes de su uso. Sistema Perfuse Langendorff con KaJaB para eliminar cualquier resto de agua del sistema y tampón de reserva. Para los ratones, ajustar la velocidad inicial de la bomba a ~ 2,0 ml / min. Coloca 2-0 y 4-0 suturas de seda cerca de cánula de perfusión. Haga funcionar la bomba hasta que el tubo y el aparato se llenan ingenioh perfundido y garantizar la strup burbuja se llena de líquido de perfusión. NOTA: Para largos períodos de perfusión y función estable se recomienda instalar un filtro de fibra de vidrio en línea (~ 1 m) en el circuito de perfusión, a percibir los precipitados que podrían formar coágulos en el corazón </li></ol> 3. Ratón Cirugía 3.1) Ratón Anestesia y Manejo <ol><li> Prepare la jeringa con la dosis de anestesia de 80 mg / kg de ketamina y 5 mg / ml mezcla de xilazina, y añadir estéril al 0,9% de solución salina para que aparezca volumen a 0,2 ml. Inyectar heparina IP (50 l de solución de 1000 U / ml). </li><li> Coloca el ratón de nuevo en contenedor de transporte (~ 10 a 20 min) y esperar a que se pierda la conciencia como la heparina en vigor. Periódicamente hacer una pizca dedo del pie para controlar el dolor reflejo. </li></ol> 3.2) Remover el Corazón <ol><li> Una vez que el ratón es totalmente inconsciente y no responde a pizca dedo del pie, asegurar a una mesa de operaciones apropiado usando alfileres o 25 G<html> puntas de jeringa a través de las extremidades. Realizar una toracotomía para exponer el corazón. Corte un pequeño agujero justo debajo del esternón y extender el corte a los lados del ratón evitando el diafragma. </li><li> Cortar rápidamente el diafragma y luego se corta rápidamente por los lados de la caja torácica. Voltear hacia atrás de la caja torácica como una concha de almeja para exponer la cavidad torácica. Sujete con suavidad el corazón, coloque unas tijeras debajo y quitar el corazón. NOTA: Es esencial para eliminar rápidamente el corazón una vez que se expone en la cavidad torácica y los pulmones no son funcionales. </li></ol> 3.3) Limpiar el Corazón <ol><li> Coloque el corazón en el plato que contiene hielo KaJaB frío y recortar los trozos grandes de tejido pulmonar adjuntos. Utilice pinzas para recoger el corazón y localizar la aorta. Apriete suavemente el corazón y buscar sangre que aparece, ya que este debe ser el extremo abierto de la aorta. Utilice unas pinzas de punta fina para mantener el corazón por el extremo abierto de la aorta. </li></ol>e &quot;&gt; 4. Montaje del Corazón, A partir de perfusión, y colocar el globo 4.1) Montaje y canulación del Corazón <ol><li> Antes de transportar el corazón al aparato Langendorff, encender la bomba de asegurar que la presión de perfusión es baja (~ 20 mmHg). Mantenga el corazón por la aorta justo debajo de la cánula. El uso de otro conjunto de pinzas de punta fina, abra cuidadosamente la aorta y deslice corazón para arriba sobre la cánula. Mantenerlo en su lugar con un juego de pinzas y luego usar un clip de bordes suaves para asegurar temporalmente a la cánula. NOTA: montaje rápidamente el corazón a la cánula de perfusión es crítico para una buena preparación. Con la experiencia, los procedimientos de apertura de la cavidad torácica, hasta el montaje del corazón deben tomar entre 1 y 2 minutos. </li><li> Ate e iniciar la perfusión de la siguiente manera, utilizando 4-0 sutura de seda aorta seguro a la cánula directamente debajo del clip. Asegúrese de que el empate es también alrededor de la cánula aórtica de metal, por lo que la aorta no quede amarrado al apretarel nudo. Una vez que un empate se coloca con firmeza, quite el clip. </li><li> Use suturas de seda adicionales para sujetar la aorta con seguridad a la cánula asegurándose de atar abajo las ramas de los vasos que pueden estar saliendo de la aorta. Estos a menudo se pueden observar por fugas de perfusión o disparar hacia fuera de la aorta. NOTA: Durante las etapas iniciales de la perfusión de la sangre debe ser lavado con el corazón y el corazón entero debería aparecer un color rosa suave. Decoloraciones oscuras que no se lavan a cabo indican áreas isquémicas probablemente debido a la embolia de aire o coágulos y el corazón no debe ser utilizado. </li></ol> 4.2) El establecimiento de Medición de perfusión y LVP <ol><li> Poco a poco aumentar la presión de perfusión y aumentar la velocidad de la bomba hasta que la presión de perfusión llega a 70 mmHg. NOTA: Las presiones de perfusión estándar para la perfusión del ratón pueden ser 70 a 90 mmHg, pero debe mantenerse constante de animal a animal dentro de un experimento. </li><li> Limpiar el tejido restante (pulmón, tiroides etc.) Que todavía puede estar unido al corazón. Utilice unas tijeras para cortar la aurícula izquierda con el fin de crear una abertura en el ventrículo izquierdo. </li><li> Coloque el globo en el soporte y desinflar. Coloque la cánula globo cerca de la cánula aórtica, directamente sobre la abertura en el ventrículo izquierdo. Inserte cuidadosamente el globo a la baja en el ventrículo izquierdo mientras mantiene el corazón en su lugar para la aorta no se rompa. </li><li> Una vez que está en su lugar lentamente comenzar a inflar el globo hasta que la PTDVI alcanza ~ 8 mmHg. Coloque la sonda de temperatura contra la parte inferior del corazón por lo que mide la temperatura del efluente. </li></ol> 4.3) Medición Basal <ol><li> Sellar el corazón en una cámara de perfusión con camisa de agua. Durante este tiempo perfundir continuamente el corazón con KHB, y asegúrese de que la temperatura sigue aumentando. Controlar la temperatura y ajustar el baño de agua en consecuencia hasta que alcanza aproximadamente ~ 37 ºC. NOTA: Control temperatUre en las fases iniciales de la perfusión es fundamental como flujos coronarios y, posteriormente, la temperatura puede variar de corazón a corazón. Temperatura del perfundido efluente se monitorizó para la temperatura deseada del miocardio a través de una sonda de temperatura colocado en el ápice del corazón. Además, en comparación con otros protocolos de perfusión Langendorff, el corazón no está sumergido en el CP o KaJaB durante la perfusión o arresto, esto se hace principalmente para ajustar rápidamente la temperatura, así como proporcionar la entrega CP eficiente sin difusión. </li><li> Comenzar a grabar de forma continua la medición funcional utilizando un sistema de adquisición de datos conectado a los sensores apropiados, incluyendo la presión de perfusión, la presión ventricular izquierda (transductor de presión conectado a LVP globo), la temperatura y los parámetros electrofisiológicos (EKG, MAP si está equipado) (apego será de acuerdo a los fabricantes y específica a los sensores individuales y sistema de adquisición de datos). Una vez que el efluente KHB llega a ~ 37 ºC durante al menos 15<html> min y parámetros funcionales cardíacos son estables, tenga en cuenta el momento de las mediciones de referencia. NOTA: Los criterios de inclusión / exclusión se aplican a cada corazón. Un LVDP de &lt;60 mmHg al inicio del estudio indica un corazón que debe ser removido de su análisis. Además, el flujo coronario&gt; 4,5 ml / min, o incapacidad para mantener la presión de perfusión al inicio del estudio probablemente indica una fuga o aorta desgarrado. También cualquier corazones que tienen áreas claras isquémicos que pueden ser confirmados visualmente (es decir, coágulos) o reducciones de isquemia asociada exhiben en la función cardiaca (es decir, el aumento de PDFVI, extremadamente arrítmico) se eliminan del análisis. </li><li> Medir el flujo coronario a través de la colección del efluente coronario en un cilindro graduado de 1 min. Cierre de la cámara y permitir la temperatura y función para volver a los valores basales. Alternativamente medir el flujo coronario de forma continua en la línea de perfusión a través de una sonda de flujo colocado después del circuito de descarga de presión. </li></ol>&quot;&gt; 5. Iniciación cardioplégico Arresto <ol><li> Colocar 100 ml de tampón de cardioplegia fría en otro depósito y. transferir el depósito cánula KHB al depósito de cardioplegia. </li><li> Separe la carcasa con camisa de agua y el circuito de calentamiento de la perfusión del baño de agua caliente y conectarse a la máquina refrigerante utilizando tubería desconexiones rápidas. Utilice calefacción y refrigeración circuladores independientes para permitir cambios rápidos de temperatura del corazón y perfusión. </li><li> Siga la burbuja de aire que consigue introduce en el tubo durante el interruptor, y una vez que alcanza cerca del corazón aislado iniciar la temporización para cardioplegia. Entregar cardioplejía durante 2 min. Después de la dosis inicial parar la bomba. Asegúrese de detener el corazón en diástole y estar cerca de la temperatura CP deseada. NOTA: Una trampa de burbujas suficiente es necesario para evitar embolias de aire en el corazón. Alternativamente, un sistema de suministro para ambos depósitos conmutadas por una llave de paso puede ser construido fácilmente, sin embargo encontramos seguiring la pequeña burbuja de aire que se introduce cuando el intercambio de la cánula entre los depósitos, un método fácil de la entrega CP momento dado potencialmente diferentes velocidades de la bomba entre los experimentos (es decir, debido a ratón / rata, la presión de perfusión, la resistencia del filtro, etc.) </li><li> Mantener el corazón en cardioplejía durante 2 horas a ~ 20 ºC. Cada media hora durante la CP encender la bomba de nuevo durante 1 minuto por lo que se administra otra dosis. NOTA: dosis intermitentes de CP cada 30 min resultados en el deterioro funcional del corazón sin necrosis del tejido. Los períodos más largos entre las dosis de CP (es decir,&gt; 45 min) pueden dar lugar a la necrosis y la contractura isquémica y sería más apropiado para un modelo de lesión necrótica asociada a la isquemia sin protección. </li></ol> 6. La reperfusión <ol><li> Al final de CP, transferir la cánula depósito de vuelta a la oxigenada KHB. Conectar los circuitos de control de temperatura en el termostato de calefacción y encienda la bombaa comenzar la reperfusión. En este punto el cardioplejia hace desaparecer, observar el aumento de la temperatura y el corazón comienza a latir de nuevo después de 2-4 min de reperfusión. Cuando se inicia el corazón el latido del corazón es lento ya menudo arrítmico. NOTA: Por lo general, no es un gran aumento de la LVP diastólica (es decir, aumento ≤10 mmHg), que suele ser característico en modelos de isquemia puros. Las arritmias pueden persistir hasta bien entrada la reperfusión y en ocasiones tendrán el corazón para ser desfibrilación. Esto se puede lograr con el uso de un conjunto estimulador a voltajes más altos (~ 10-50 V) y electrodos colocados en la base y el ápice del corazón. </li><li> Permitir que el corazón reperfundir durante 30 min, y durante este período de tiempo tomar mediciones del flujo coronario según sea necesario. Medir el flujo coronario por recoger el efluente con un cilindro graduado durante 30-60 seg. </li></ol> 7. Recolección de Tejidos <ol><li> Desinflar el globo y retirarlo desde el ventrículo izquierdo. Tome el corazón de lacánula y pesarlo. En los experimentos iniciales, al menos una rebanada transversal del corazón debe ser tomado y TTC tiñe para evaluar necrosis para asegurar que el corazón está libre de cualquier lesión necrótica. </li><li> Recoger las rebanadas del corazón para los estudios de microscopía, pesos húmedo / seco, etc. El resto o todo el corazón debe congelarse rápidamente colocando en nitrógeno líquido. Tienda corazones congelados en un congelador de -80 ºC. NOTA: Para la medición de compuestos de fosfato de alta energía (es decir, el ATP, fosfato de creatina), los corazones se debe congelar inmediatamente. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Los métodos de detalles de protocolo precedentes para evaluar el aturdimiento miocárdico secundaria a isquemia global asociado con parada cardiopléjica. En nuestras manos este protocolo produce una reducción aproximada del ~ 40% de la función cardíaca (LVDP, +/- dP / dt) con cambios mínimos en la frecuencia cardíaca en el punto de tiempo posterior a la reperfusión 30 min. A medida que el corazón está reperfunde y recalentado todos los parámetros de la función cardíaca se reducen en los puntos iniciales de ...

Aturdimiento miocárdico se define como reversible reducción de la actividad contráctil a pesar de la restauración del flujo sanguíneo adecuado después de un breve período de isquemia o períodos prolongados de insultos isquémicos con 1,2,3,4,5 cardioprotección. El método presentado se utiliza específicamente para modelar insultos isquémicos clínicamente relevantes que pueden resultar en alteraciones reversibles en la función contráctil (es decir, los insultos isquémicos asociados con la cirugía cardíaca utilizando parada cardiopléjica, breves períodos de isquemia, angina de pecho, etc.). En contraste con los estudios de isquemia grave (infarto de miocardio, necrosis) fue desarrollado este protocolo para evaluar la recuperación funcional del miocardio y la cardioprotección sin lesión de los tejidos, remodelación, y la muerte celular. La mayoría del trabajo se analiza un protocolo de parada cardiopléjica estándar con elementos similares a una cirugía cardíaca utilizando la hipotermia y la entrega cardioplejía intermitente. Prot miocardioreflexión durante la mayoría de las cirugías cardíacas se basa en cardioplegia y bypass cardiopulmonar. Aunque cardioplejía soluciones y estrategias (CP) varían ampliamente (sangre, cristaloide, frío, caliente etc.) los elementos más comunes son 1) la hiperpotasemia y / u otras estrategias para detener el corazón en diástole, limitando así la utilización de energía resultante de la contracción miocárdica, y 2) la hipotermia para ralentizar el metabolismo y ayudar a mantener la ATP y otras reservas de energía mientras arrestado. Soluciones de cardioplejía actuales proporcionan protección al corazón contra los insultos isquémicos que de otro modo resultarían letales. Sin embargo, las estrategias cardioprotectoras durante insultos isquémicos quirúrgicos no son perfectos, y la lesión isquémica leve resultante puede dar lugar a una disfunción contráctil cardiaca reversible pesar de un flujo sanguíneo adecuado (aturdimiento miocárdico), acidosis, daños cardiomiocitos, y los efectos vasculares incluyendo la perfusión coronaria reducida y el vasoespasmo. Este protocolo se diferenciaa partir de modelos de isquemia del corazón aislado estándar evaluación de infarto de miocardio e isquemia severa en que se evalúa insultos isquémicos más suaves que puede resultar en la función cardiaca deteriorada siguiente breve isquemia o insultos isquémicos asociados con la parada cardiopléjica. (Para una revisión de técnicas de perfusión Langendorff y I / R en ver 6-8). Para obtener directrices generales y un análisis exhaustivo de los parámetros experimentales asociadas con aislados de ratones corazones perfundidos ver Sutherland e t al. 2003 9 La técnica que aquí se presenta detalla el equipamiento necesario, reactivos, pasos, estrategias y consejos para inducir de manera fiable impresionante en los corazones de ratón. Pequeñas modificaciones son necesarias para aplicar la técnica a ratas. Brevemente corazones aislados de ratones se Langendorff perfundidos durante aproximadamente 30 minutos con tampón fisiológico Krebs-Henseleit (KHB), seguidos por el frío paro cardiaco protegida a través de la entrega de una hipotermia hipercaliémicasolución de cardioplejía ic. Tras la detención, la recuperación funcional cardíaca se controla durante el recalentamiento y la reperfusión del corazón con KHB. Los cambios en el grado de recuperación de la función contráctil cardiaca pueden ser evaluados para evaluar agentes cardioprotectores y diferentes estrategias de cardioprotección.

<table><tbody><tr><td>Cardioplegia Solution (St Thomas II)</td><td></td><td></td><td>Symbol / Concentrations (mM)</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td></td><td></td><td>NaCl; 110</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td></td><td></td><td>KCl; 16</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td></td><td></td><td>CaCL2; 1.5</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td></td><td></td><td>MgCL2; 16</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td></td><td></td><td>NaHCO3; 10</td></tr><tr><td>Krebs-Heinslet Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td></td><td></td><td>NaCl; 118</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td></td><td></td><td>KCl; 4.8</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td></td><td></td><td>MgSO4; 1.7</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td></td><td></td><td>NaHCO3; 24.9</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate (monobasic)</td><td></td><td></td><td>KH2PO4; 1.2</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td></td><td></td><td>CaCL2; 1.4</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td></td><td></td><td>Na pyruvate; 2</td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td></td><td>C6H12O6; 6</td></tr><tr><td>Balloon reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corn Syrup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spaghetti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon Dispersion Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>styrofoam block</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lab oven/incubator ( 50C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Langendorff Perfusion equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heated water circulator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cooling water circulator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump capable of 2-30 ml/min</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inline perfusion filters - 1 um glass fiber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small graduated cylinder (~10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>perfusion resevoir (1L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cardioplegia resevoir (~200 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gas bubbler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95/5 O2/CO2 mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical tools and reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum and Potz surgical scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>two Dumont size 5 forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ketamine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>xylazine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silk 2-0 and 4-0 sutures</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest

El siguiente protocolo es de utilidad para evaluar la función cardiaca deteriorada o elevando insultos isquémicos moderados miocardio. La técnica es útil para el modelado de la lesión isquémica asociada con numerosas fenómeno clínicamente relevante, incluyendo cirugía cardíaca con parada cardiopléjica y bypass cardiopulmonar, la cirugía sin CEC, trasplante, angina, isquemia breve, etc. El protocolo presenta un método general para modelar hipotermia arresto cardioplégica hipercaliémica y reperfusión en los corazones de roedores que se centran en la medición de la función contráctil del miocardio. En resumen, un corazón de ratón se perfunde en el modo de Langendorff, equipado con un globo intraventricular, y se registran los parámetros funcionales cardíacos iniciales. Tras la estabilización, el corazón se somete a breves infusión de una solución de cardioplejía hipotermia cardioprotector para iniciar arresto diastólica. Cardioplegia se entrega de forma intermitente durante 2 horas. El corazón está entonces reperfundido y Warmed para las temperaturas y la recuperación de la función miocárdica normotérmicos se supervisa. El uso de este protocolo los resultados en función contráctil cardiaca deprimida confiable libres de daño en el tejido miocárdico bruto en roedores.

La Figura 1 presenta los resultados típicos de un experimento del ratón. LVP (línea roja), dP / dt (línea verde), y la temperatura (línea morada) se registraron continusouly sobre ~ 3 horas. Las letras indican a - medida de referencia, b, c, d, e - la entrega de la solución de cardioplejía, f - inicio de la reperfusión, g, h, i, j - medición de flujo cornary durante la reperfusión. Nota, LVDP deprimido y dP / dt en la reperfusión en comparación con la línea base. Figura 1B ...

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Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Murino Aislado Modelo Corazón de aturdimiento miocárdico asociado a paro cardioplégico

The following protocol is of use to evaluate impaired cardiac function or myocardial stunning following moderate ischemic insults. The technique is useful ...

murine-isolated-heart-model-myocardial-stunning-associated-with

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

11.6K vistas.  Brown University. The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Video: Murine Isolated Heart Model of Myocardial Stunning Associated with Cardioplegic Arrest

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused by whole-body hypoperfusion.5,6 Successful reproduction of whole-body hypoperfusion in rodent models has been fraught with 
difficulty.7-9,9,10 Models which employ focal ischemia have repeatedly demonstrated results which do not translate to the clinical setting, and larger 
animal models which allow for whole body hypoperfusion lack access to the full toolset of genetic manipulation possible in the mouse.11,12 However, in recent 
years a mouse model of cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation has emerged which can be adapted to model AKI.13 This model reliably reproduces 
physiologic, functional, anatomic, and histologic outcomes seen in clinical AKI, is rapidly repeatable, and offers all of the significant advantages of a murine surgical 
model, including access to genetic manipulative techniques, low cost relative to large animals, and ease of use. Our group has developed extensive experience 
with use of this model to assess a number of organ-specific outcomes in AKI.14,15

A powerful model for perioperative and critical care related acute kidney injury is presented. Using whole body hypoperfusion induced by cardiac arrest it is possible to nearly replicate the histologic and functional changes of clinical AKI.

Arresto normotérmica cardiaca y reanimación cardiopulmonar: un modelo de ratón de la lesión por isquemia-reperfusión

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

Investigación

Medicina

A Murine Closed-chest Model of Myocardial Ischemia and Reperfusion

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ischemia and reperfusion. Immune response includes cytokine expression and release or secretion of endogenous ligands of innate immune receptors. Activation of innate immunity can potentially modulate infarct size. We have modified an existing murine closed-chest model using hanging weights which could be useful for studying myocardial pre- and postconditioning and the role of innate immunity in myocardial ischemia and reperfusion. This model allows animals to recover from surgical trauma before onset of myocardial ischemia.
Volatile anesthetics have been intensely studied and their preconditioning effect for the ischemic heart is well known. However, this protective effect precludes its use in open chest models of coronary artery ligation. Thus, another advantage could be the use of the well controllable volatile anesthetics for instrumentation in a chronic closed-chest model, since their preconditioning effect lasts up to 72 hours. Chronic heart diseases with intermittent ischemia and multiple hit models are other possible applications of this model.
For the chronic closed-chest model, intubated and ventilated mice undergo a lateral blunt thoracotomy via the 4th intercostal space. Following identification of the left anterior descending a ligature is passed underneath the vessel and both suture ends are threaded through an occluder. Then, both suture ends are passed through the chest wall, knotted to form a loop and left in the subcutaneous tissue. After chest closure and recovery for 5 days, mice are anesthetized again, chest skin is reopened and hanging weights are hooked up to the loop under ECG control.
At the end of the ischemia/reperfusion protocol, hearts can be stained with TTC for infarct size assessment or undergo perfusion fixation to allow morphometric studies in addition to histology and immunohistochemistry.

Surgical trauma induces an inflammatory response. Cytokines and endogenous ligands are known to modulate myocardial infarct size following ischemia and reperfusion. We present a modified closed-chest model of murine ischemia and reperfusion using hanging weights to minimize effects of thoracotomy.

Un murino tórax cerrado modelo de isquemia y reperfusión miocárdica

Surgical trauma by thoracotomy in open-chest models of coronary ligation induces an immune response which modifies different mechanisms involved in ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

En Vivo evaluación cuantitativa de la estructura miocárdica, la función, perfusión y viabilidad Usando computarizada micro-tomografía cardiaca

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Bioingeniería

Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality worldwide. In humans, a pathologic occlusion forms in a coronary artery and reperfusion of that occluded artery is considered essential to maintain viability of the myocardium at risk. Although essential for myocardial recovery, reperfusion of the ischemic myocardium creates its own tissue injury. The physiologic response and healing of an ischemia/reperfusion injury is different from a chronic occlusion injury. Myocardial ischemia/reperfusion injury is gaining recognition as a clinically relevant model for myocardial infarction studies. For this reason, parallel animal models of ischemia/reperfusion are vital in advancing the knowledge base regarding myocardial injury. Typically, ischemia of the mouse heart after left anterior descending (LAD) coronary artery occlusion is confirmed by visible pallor of the myocardium below the occlusion (ligature). However, this offers only a subjective way of confirming correct or consistent ligature placement, as there are multiple major arteries that could cause pallor in different myocardial regions. A method of recording electrocardiographic changes to assess correct ligature placement and resultant ischemia as well as reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, would help yield consistent infarct sizes in mouse models. In turn, this would help decrease the number of mice used. Additionally, electrocardiographic changes can continue to be recorded non-invasively in a time-dependent fashion after the surgery. This article will demonstrate a method of electrocardiographically confirming myocardial ischemia and reperfusion in real time.

During murine myocardial ischemia/reperfusion surgery, correct placement of the occluding ligature is typically confirmed by visible observation of myocardial pallor. Herein, a method of electrocardiographically confirming ischemia and reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, is demonstrated in male C57Bl/6 mice.

La confirmación de la isquemia miocárdica y reperfusión en ratones utilizando electrocardiografía de superficie del cojín

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

Un modelo de roedor isquémico de pericardio intacto

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

Un modelo de ratón para estudiar la fisiología del cerebro durante un paro cardíaco

Mouse Cardiac Arrest Model for Brain Imaging and Brain Physiology Monitoring During Ischemia and Resuscitation

Most cardiac arrest (CA) survivors experience varying degrees of neurologic deficits. To understand the mechanisms that underpin CA-induced brain injury and, subsequently, develop effective treatments, experimental CA research is essential. To this end, a few mouse CA models have been established. In most of these models, the mice are placed in the supine position in order to perform chest compression for cardiopulmonary resuscitation (CPR). However, this resuscitation procedure makes the real-time imaging/monitoring of brain physiology during CA and resuscitation challenging. To obtain such critical knowledge, the present protocol presents a mouse asphyxia CA model that does not require the chest compression CPR step. This model allows for the study of dynamic changes in blood flow, vascular structure, electrical potentials, and brain tissue oxygen from the pre-CA baseline to early post-CA reperfusion. Importantly, this model applies to aged mice. Thus, this mouse CA model is expected to be a critical tool for deciphering the impact of CA on brain physiology.

Autor destacado: Un modelo de ratón único de paro cardíaco inducido por asfixia 

This protocol demonstrates a unique mouse model of asphyxia cardiac arrest that does not require chest compression for resuscitation. This model is useful for monitoring and imaging the dynamics of brain physiology during cardiac arrest and resuscitation.

Modelo de paro cardíaco en ratón para la obtención de imágenes cerebrales y la monitorización de la fisiología cerebral durante la isquemia y la reanimación

Most cardiac arrest (CA) survivors experience varying degrees of neurologic deficits. To understand the mechanisms that underpin CA-induced brain injury ...

Neurociencias

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roedor de Trabajo Modelo del corazón para el estudio sobre los resultados de miocardio y el consumo de oxígeno

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Murino Aislado Modelo Corazón de aturdimiento miocárdico asociado a paro cardioplégico

Resumen

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En Vivo evaluación cuantitativa de la estructura miocárdica, la función, perfusión y viabilidad Usando computarizada micro-tomografía cardiaca

La confirmación de la isquemia miocárdica y reperfusión en ratones utilizando electrocardiografía de superficie del cojín

Modelo de infarto de miocardio murino usando ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda

Un modelo de roedor isquémico de pericardio intacto

Modelo de paro cardíaco en ratón para la obtención de imágenes cerebrales y la monitorización de la fisiología cerebral durante la isquemia y la reanimación

Modelo de paro cardíaco en ratón para la obtención de imágenes cerebrales y la monitorización de la fisiología cerebral durante la isquemia y la reanimación

Modelo de paro cardíaco en ratón para la obtención de imágenes cerebrales y la monitorización de la fisiología cerebral durante la isquemia y la reanimación

Roedor de Trabajo Modelo del corazón para el estudio sobre los resultados de miocardio y el consumo de oxígeno