Name: isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells
Uploaded: 2014-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
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Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01 AI088209 (a KAH). También agradecemos a la Universidad de Minnesota Flujo de Recursos Citometría.

En este estudio, los adultos - se utilizaron (6 8 semanas) hembra C57BL / 6 ratones. Los ratones se adquirieron en el Instituto Nacional del Cáncer y mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. La Universidad de Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Minnesota (IACUC) aprobó toda la experimentación animal. 1 Preparación de Instrumentos y búferes <ol><li> Preparar la solución de enzima (medio RPMI 1640 con 0,05% [w / v] de Liberase TH y 100 U / ml de DNasa I), tampón rico en albúmina (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + libre] con 0,5% de suero bovino mM de ácido etilendiaminotetraacético albúmina y 2 [EDTA]), tampón FACS (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + libre] que contiene suero bovino fetal al 1% [FBS] y 0,02% NaN 3), FACS clasificación tampón (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + libre] que contiene 2% de FBS), y medio RP10 (medio RPMI-1640 suministrado con FBS al 10%). </li><li> Preparar 10 placas paneo. Preparar la solución de recubrimiento 40 ml (0,01 mg / ml de Gavena anti-IgG de rata en 0,1 M NaHCO3 Buffer), y añadir 4 ml de solución de revestimiento en cada placa de 100 mm x 15, remolino e incubar a 4 ° CO / N. Vierta la solución de anticuerpo y enjuagar la placa con 5 ml de 1x PBS durante 2 horas, agite vigorosamente entre enjuagues. Guarde las placas preparadas a 4 ° C. </li></ol> 2. Cosecha de Timo Tejido <ol><li> La eutanasia de ratón en una cámara de CO 2. Coloque el animal sobre su espalda sobre una estera de disección, fijar los pies en el felpudo y humedecer la piel mediante pulverización con etanol al 70%. </li><li> Hacer una incisión en la línea media a través de la piel, a partir de por encima de la abertura de la uretra hacia arriba a la mandíbula inferior con una tijera y extender la incisión hacia abajo para las rodillas en ambos lados. La incisión se ve como un revés de &quot;Y&quot;. Tire de la piel suelta de nuevo en los lados, y el pin a la lona disección. </li><li> Perforar el diafragma del xifoides, cortar las costillas en cada lado hasta alrededor de la clavícula, luego levante las costillas confórceps y el pin a la lona disección. El timo es justo debajo de las costillas, y se ve como dos lóbulos blancas finas que recubren el corazón (Figura 1). Tejido conectivo que rodea Desconecte el timo, tirar y eliminar el par de lóbulos del timo con pinzas dentadas curvadas suavemente. Lóbulos del timo lugar en una placa de 6 pocillos que contenía 5 ml de medio RPMI-1640. </li></ol> 3. Preparación de las células del estroma tímico <ol><li> Recortar cualquier tejido graso y conectivo circundante y transferir los lóbulos del timo a un nuevo pocillo de la placa de 6 pocillos que contiene 5 ml de solución de enzima recién preparan. Hacer pequeñas incisiones en los lóbulos del timo con tijeras finas, y se incuba la placa a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Pipetear suavemente digerir tejido del timo arriba y abajo 2-3 veces usando la pipeta 5 ml para la disociación del tejido. Recoger la fracción de sobrenadante en un tubo de 50 ml que contiene 10 ml de tampón de albúmina rica en frío para neutralizar enzimas. Mantener el tubo de recogida en hielo. Añadir 2,5solución de enzima ml para el tejido restante y se incuba la placa a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Realizar agitación mecánica suave con una jeringa de 3 ml y 18 g de aguja para romper los agregados. Piscina sobrenadante en el tubo de recogida. Añadir 2,5 ml de solución de enzima para el tejido restante y se incuba la placa a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Repita la agitación mecánica suave con una jeringa de 3 ml y una aguja de 25 G, y se incuba la placa adicional de 5 - 10 min. </li><li> Después de la digestión completa, piscina el sobrenadante en el tubo de recogida. Centrifugar el tubo de recogida a 400 xg, 4 ° C durante 8 min para recoger las células. Aspirar el líquido y suspender las células sedimentadas en 10 ml de tampón de albúmina-rica y filtrar la muestra a través de malla de 100 mm. Contar las células utilizando un hemocitómetro. A continuación, realice el análisis de flujo cytometic (Sección 4) o el enriquecimiento TEC (Sección 5). </li></ol> 4. Identificación del TEC por Citometría de Flujo </p&gt; <ol><li> Preparar las células para una concentración final de 4 x 10 6 células por 100 l en tampón de FACS para la tinción en una placa de ensayo de pocillos de fondo redondo 96 y mantener la placa en hielo. Añadir 20 l solución de bloqueo Fc (-anticuerpo anti CD16 / CD32 a 10 mg / ml en tampón FACS) a las células e incubar las células durante 10 min en hielo. Haga girar la placa a 400 xg, 4 ° C durante 3 min. Deseche el líquido de los pozos con un movimiento rápido de la cara de la placa hacia abajo en un fregadero. </li><li> Suspender las células sedimentadas en 100 l cóctel de anticuerpos (anti-CD45, -EpCAM, clase MHC II, y -Ly51 anticuerpos, y la lectina UEA-1 marcado con diferentes fluorocromos en fabricante recomienda o probado concentraciones óptimas de cada anticuerpo en tampón FACS ), y se incuban las células en hielo durante 20 min en la oscuridad. Para la compensación, manchar 1 x 10 6 células con cada fluorocromo individual. </li><li> Añadir 100 l de tampón de FACS a cada pocillo y girar la placa a 400 xg, 4 ° C durante 3 min. Repita el paso de lavado setiempo y, a continuación, volver a suspender las células en tampón de FACS 100 l. Transferir las células a un tubo de FACS de fondo redondo de 12 x 15 mm lleno de 300 l de tampón FACS. Adquirir las muestras en el citómetro de flujo y análisis de datos utilizando el software de análisis FACS. Estrategia gating TEC se muestra en la Figura 2. </li></ol> 5. Enriquecimiento del TEC por Toma panorámica <ol><li> Centrifugar las células del timo (que se formulan en la sección 3) a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. Aspirar el líquido y suspender las células sedimentadas en tampón de clasificación de FACS en una concentración de 2 x 10 8 células por ml en un tubo cónico de 15 ml o 50 ml. Añadir anticuerpo anti-CD90.2 (Clon 30-H12) (o anti-CD45) a una concentración final de 2,5 mg / ml de suspensión celular y se incuban las células suavemente en un mezclador que gira a 4 ° C durante 30 min. Después de la incubación, lavar con un 5 - 10 veces el volumen de medio RP10 y se centrifuga el tubo a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar el líquido y resuspender las células sedimentadas enRP10 medio a una concentración de 1 x 10 7 por ml. Añadir 5 ml de suspensión celular a cada placa recubierta panning (preparado en la Etapa 1.3), remolino y se incuba durante 30 min a TA. Agitar vigorosamente; transferir los sobrenadantes en un tubo cónico. Enjuague la placa dos veces con medio RP10 y agrupar los sobrenadantes en el tubo de recogida. </li><li> Centrifugar el tubo de recogida a 400 xg, 4 ° C durante 5 min. Aspirar el líquido y resuspender las células sedimentadas en medio RP10 5 ml. Añadir la suspensión celular a una nueva placa de paneo, agitar e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Recoger las células enjuagar la placa y piscina para ellos en un tubo cónico. Una vez TEC se enriquecen, de girar las células a 400 xg, 4 ° C durante 5 min y la suspensión de células en 5 ml de tampón FACS clasificación. </li></ol> 6. Purificación del TEC por la clasificación de células <ol><li> Contar las células usando un hemocitómetro y preparar la suspensión de células a una concentración de 4 x 10 7 células en tampón de clasificación FACS. Añadir anticuerpos described en la Sección 4.4 en solución de células e incubar las células suavemente en un mezclador que gira a 4 ° C durante 30 min. Después de la tinción, lavar y suspender las células a una concentración de 10 x 10 6 células por ml de tampón de clasificación FACS. </li><li> Ordenar subconjuntos TEC través de una boquilla 100 mM usando la clasificación de células activadas por fluorescencia. Ordenado de células se recogen en 30% (v / v) de FBS en medio RPMI-1640). Una vez que la clasificación de células se realiza, centrifugar las células a 400 xg, 4 ° C durante 5 min y se preparan para análisis de aguas abajo. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En el protocolo, los pasos críticos son la preparación de las células del estroma del timo (Sección 3) y el enriquecimiento de los TEC (Sección 4). Se recomienda firmemente que la solución de enzima fresca se prepara cada vez y el tejido se trata tan pronto como sea posible. Para timos agrupado, se requiere optimizar el volumen de solución de enzima en función del número de timos. Si cualquier residuo de tejido que queda después de la transformación, la adición de más solución de enzima y la extensión del...

Temprano en el desarrollo de células T, la médula ósea madre hematopoyéticas progenitoras multipotentes derivadas de células son reclutados a la corteza del timo, someterse compromiso de linaje T y se convierten en precursores de células T 1. En la corteza, precursores de células T CD4 y CD8 doble negativos (DN) timocitos se expanden y se diferencian en células CD8 doble positiva (DP) timocitos inmaduros CD4 y, formando un gran grupo de progenitores con receptores de células T altamente variable 1. Sólo un selecto subconjunto restringido por MHC de las células DP se convertirá en único positivos (SP) timocitos CD4 o CD8, migran a la médula del timo, y se diferencian en células T maduras funcionalmente competentes, un evento que se conoce como selección positiva 2 6. En contraste, los clones de los timocitos autorreactivos se someten a selección negativa y se eliminan a través de la apoptosis, convertido a las células T reguladoras para la auto-tolerancia, o desviado a los linfocitos intraepiteliales para los propósitos que aún no están claras 3,7-10. En el timo, las células estromales tímicas forman un microambiente único que proporciona señales para estos diversos destinos de desarrollo de células T 5,11,12. Células del estroma tímico se componen de células epiteliales del timo (TEC) - incluyendo TEC corticales (CTEC) y TEC medulares (mTECs), células dendríticas, macrófagos, fibroblastos, células endoteliales, pericitos derivadas de la cresta neural y otras células mesenquimales 13-15. Entre estos, TEC son cruciales en las diversas etapas de desarrollo de células T 1,2,16,17. Sin embargo, la falta de una manera robusta para aislar TEC ha obstaculizado una comprensión global de sus funciones 16. En particular, CTEC, que forman una red tridimensional que rodea a los progenitores en la corteza, son esenciales para la selección positiva 13,18,19 por razones que aún no están claras. Estudios anteriores proporcionaron pistas sobre la heterogeneidad y el papel de los TEC, sobre todo contando con herramientas morfológicas e histológicas 13 </sup&gt;. Recientemente las funciones únicas de subconjuntos TEC fueron abordados por enfoques genéticos en modelos de ratón 12,20. Una manera robusta y reproducible para aislar TEC es fundamental para lograr la caracterización objetiva de subconjuntos TEC, la evaluación cuantitativa y cualitativa de las funciones TEC, y la aclaración de los mecanismos de cómo CTEC apoyan la selección positiva. Debido a la rareza de TEC en el timo y las interacciones apretados forman en el órgano intacto, el aislamiento de TEC ha sido desafiante. El protocolo descrito aquí se basa en descubrimientos anteriores, actualmente reactivos disponibles, las técnicas y el conocimiento de la estructura y composición del estroma del timo. Hace casi dos décadas, se reportaron varios procedimientos para desagregar los tejidos del timo 21-27, en el que se utilizaron diferentes enzimas durante la digestión, incluyendo tripsina, colagenasa y dispasa. Gray et al. comparado esas enzimas en su precedure 28, e informó de una mejora de la metanfetaminaod con la digestión de múltiples pasos de cócteles enzimáticos 29 que se hicieron ampliamente utilizado 20,30. Sin embargo, este método implica un largo tiempo de preparación y los pasos y los resultados de digestión complejos en el número de células y proporciones de TEC última variable, incluso en la misma cohorte murino 29,30. Hace varios años, Liberase enzima grado de investigación, con adición altamente purificada de colagenasa y proteasa neutra se empezó a utilizar en la disociación del tejido del timo 30. A continuación, describimos un protocolo basado en la digestión-Liberase, con procedimientos de separación mecánica optimizados, que produce un alto número de TEC viables a partir de tejidos de timo de ratón. . Para enriquecer las células del estroma disociadas, estudios previos han utilizado tanto los gradientes de densidad o la separación de cuentas magnéticas 21,29. Sin embargo, ambos métodos causan severa perdida de ciertas poblaciones de células del estroma del timo, en particular la población de CTEC 29. Eliminación citotóxica y técnicas de paneo <shasta&gt; 31,32 han sido ampliamente utilizados para el agotamiento o la separación de los linfocitos en el campo inmunológico 12,31. Después de la comparación de estas técnicas, hemos establecido el protocolo actual de panoramización para el enriquecimiento de TEC. La condición suave durante el procedimiento de enriquecimiento conduce a una menor muerte celular e imparcial y una mayor recuperación de TEC. La suspensión de células aisladas del timo se describe en la Sección 3 se puede aplicar directamente a análisis citométrico de flujo para la identificación y caracterización de subconjuntos TEC y células dendríticas. Sección 4 describe una forma sencilla y útil para identificar subconjuntos TEC utilizando citómetro de flujo multiparamétrica. Para los experimentos que buscan obtener CTEC purificados o mTECs, enriquecimiento TEC y clasificación de células procedimientos se pueden encontrar en la sección 5 y 6.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse EpCAM</td><td>eBioscience</td><td>XX-5791-YY*</td><td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC II</td><td>eBioscience</td><td>XX-5321-YY*</td><td>Clone M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly51</td><td>eBioscience</td><td>XX-5891-YY*</td><td>Clone 6C3</td></tr><tr><td>UEA-1</td><td>Vector Laboratory</td><td>FL-1061</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Flow cell sorter</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry analysis software</td><td>TreeStar - Flowjo</td><td>FlowJo v7/9</td><td></td></tr><tr><td>*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

El timo es un órgano vital para el desarrollo de linfocitos T. De las células del estroma tímico, células epiteliales del timo (TEC) son particularmente cruciales en múltiples etapas de desarrollo de células T: compromiso de las células T, la selección positiva y selección negativa. Sin embargo, la función de TEC en el timo sigue siendo incompleta entendido. En el artículo, se proporciona un método para aislar los subconjuntos TEC de timo de ratón fresco con una combinación de alteración mecánica y digestión enzimática. El método permite que las células del estroma tímico y timocitos a ser liberados de manera eficiente de célula-célula y célula-matriz conexiones extracelular y para formar una suspensión de una sola célula. Uso de las células aisladas, citometría de flujo multiparamétrica se puede aplicar a la identificación y caracterización de TEC y las células dendríticas. Debido TEC son una rara población de células en el timo, también se describe una forma eficaz para enriquecer y purificar TEC por el agotamiento de los timocitos, el tipo de célula más abundante en el timo. Folloala el enriquecimiento, el tiempo de clasificación de células se puede disminuir de modo que la pérdida de viabilidad celular puede reducirse al mínimo durante la purificación de TEC. Las células purificadas son adecuados para diversos análisis aguas abajo como el Real Time-PCR, Western blot y perfiles de expresión génica. El protocolo promoverá la investigación de la función de TEC y así como el desarrollo de la reconstitución in vitro de células T.

Usando este protocolo, un órgano timo fue retirado de un ratón adulto (Sección 2) y una suspensión de células del timo se preparó como se describe en la Sección 3. La suspensión celular obtenida constaba de timocitos, células estromales hematopoyéticas derivadas de las células del estroma y no hematopoyéticas. CD45 es un marcador pan-hematopoyético expresó en ambos timocitos y células estromales hematopoyéticas tales como macrófagos y células dendríticas. En contraste, los TEC no son de origen hematop...

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Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T.

El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.0K vistas.  University of Minnesota.  Aquí se describe un método eficiente para el aislamiento, identificación y purificación de ratón las células epiteliales del timo (TEC). El protocolo puede ser utilizado para estudios de la función del timo para el desarrollo normal de células T, la disfunción del timo, y la reconstitución de células T. 

Video: Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em&gt; En Vivo</em&gt; Y<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biología

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Inmunología e Infección

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Aislamiento y Trasplante de diferentes Aged murinos tímicos injertos.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Promoción de 3-D agregación de células epiteliales del timo FACS purificada con EAK 16-II / EAKIIH6 auto-montaje de hidrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Optimización del aislamiento de células estromales del timo y la médula ósea

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Autor destacado: Avance de la investigación hematopoyética mediante el aislamiento de células estromales para la secuenciación de células individuales

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the thymic cortex induce early T cell development and positive selection of cortical thymocytes. In contrast, medullary TECs (mTECs) in the thymic medulla attract positively selected thymocytes from the cortex and establish self-tolerance in T cells. A variety of molecules, including DLL4 and beta5t expressed in cTECs, as well as Aire and CCL21 expressed in mTECs, contribute to thymus function supporting T cell development and selection. Flow cytometric analysis of functionally relevant molecules in cTECs and mTECs is useful to improve our understanding of the biology of TECs, even though current methods for the preparation of single-cell suspensions of TECs can retrieve only a small fraction of TECs (approximately 1% for cTECs and approximately 10% for mTECs) from young adult mouse thymus. Because many of these functionally relevant molecules in TECs are localized within the cells, we describe our protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse TECs and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric AnalysisMechanisms

We describe protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the ...

El aislamiento, la identificación y purificación de células epiteliales del timo murino

Resumen

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Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

Aislamiento y Trasplante de diferentes Aged murinos tímicos injertos.

Promoción de 3-D agregación de células epiteliales del timo FACS purificada con EAK 16-II / EAKIIH6 auto-montaje de hidrogel

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis