Los autores desean agradecer MICINN (programa de apoyo a la PTA de Montserrat Porta de la Riva), AGAUR (Doctorado de Becas a Laura Fontrodona), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet programa de apoyo a Julián Cerón), y Marie Curie GRI, ISCIII y el IDIBELL para la financiación el laboratorio.

1. Protocolo A: El cultivo de gusanos de blanqueo 11 Las grandes poblaciones de C. elegans puede obtenerse mediante el cultivo de ellos, ya sea en medios líquidos o en medios sólidos en placas. Por lo general se cultiva en sólidos NGM (medios de comunicación de crecimiento de nematodos) y alimentados con E. bacteria E., que se añade a las placas ya sea vivos o muertos (muerto por UV 12, por el calor o por frío 13 14). El procedimiento más común utiliza en vivo E. OP50 coli, que es defectuoso en la síntesis de uracilo y no puede crecer más en una capa gruesa que oscurecen los gusanos. <ol><li> Mezclar 3 g de NaCl, 17 g de agar y 2,5 g de peptona y añadir 975 ml de H 2 O. Autoclave durante 50 min. </li><li> Enfriar a 55 ° C. </li><li> Añadir 1 ml de 1 M CaCl 2, 1 ml de 5 mg / ml de colesterol en etanol, 1 ml de 1 M MgSO 4 y 25 ml de 1 M KPO 4 tampón (todos ellos, pero el colesterol previamente Autoclaved). </li><li> El uso de procedimientos estériles dispensar la solución NGM en placas de Petri, placas de relleno hasta 2/3 de su volumen. </li><li> Una vez seco, es conveniente dejar las placas a temperatura ambiente durante 2-3 días antes de su uso para la detección de contaminantes. Preparar una racha de OP50 E. coli de un stock de glicerol (OP50 puede obtenerse desde el Centro de Caenorhabditis genética). </li><li> Elija una sola colonia y crecer en LB durante la noche a 37 ° C con agitación. </li><li> Permitir el exceso de humedad se evapore de las placas mediante la eliminación de la tapa en el flujo laminar y añadir OP50 al centro de las placas con una pipeta Pasteur estéril. </li><li> Deje que el E. OP50 césped coli para crecer durante la noche a temperatura ambiente oa 37 ° C durante 8 horas. </li><li> Añadir la cantidad deseada de los gusanos a las placas (si se incuban a 37 ° C las placas deben enfriarse a temperatura ambiente antes de su uso). </li></ol> CONSEJOS: <ul><li> El vertido de la misma cantidad de mediosen las placas con una pipeta o un dispensador de bomba asegura el mismo volumen de agar para las placas y se facilita el desplazamiento de la placa sin necesidad de reorientar el microscopio estereoscópico. </li><li> Placas tanto sin semillas y sin sembrar con bacterias) se pueden utilizar varias semanas después de preparado cuando se almacena en un recipiente a temperatura ambiente o 4 ° C. </li><li> Evitar placas las bacterias hasta el borde de la placa. Si el césped se extiende a los bordes de la placa de los gusanos puede arrastrarse por los lados, se secan y mueren. </li><li> Los gusanos viven más tiempo si las bacterias en las placas sembradas ya 15 muertos. </li></ul> 2. Protocolo B: El tratamiento con solución de hipoclorito alcalino (&quot;blanqueo&quot;) 11 La técnica de blanqueo se utiliza para sincronizar C. elegans culturas en la primera etapa larval (L1). El principio del método reside en el hecho de que los gusanos son sensibles a la lejía, mientras que la cáscara del huevo protege embryos de ella. Después del tratamiento con solución de hipoclorito alcalino, los embriones se incuban en medios líquidos sin alimentos, lo que permite incubar pero impide un mayor desarrollo. <ol><li> Deje que los gusanos de crecer hasta la etapa adulta. </li><li> Recuperar los adultos grávidas en tubos de 15 ml por lavado placas con tampón M9. </li><li> Pellets gusanos por centrifugación durante 2 minutos a 400xg (~ 1500 rpm en una centrífuga de mesa estándar) a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. </li><li> Realizar lavados de 1-3 hasta que el buffer aparece libre de bacterias. </li><li> Añadir la solución deseada de blanqueo (Tabla I) y agitar durante unos minutos (destrucción del tejido adulto deben ser monitoreados bajo el microscopio de disección y la reacción se detuvo cuando los rastros de los adultos son todavía visibles, que suele durar entre 3 y 9 minutos, dependiendo de varios cuestiones, tales como el volumen de gusano de pellets, mencionado en la discusión) (Fig. 3). </li><li> Detener la reacción añadiendo M9 buffer para llenar el tubo. </li><li> Centrifugar rápidamente (ya que el tratamiento todavía puede ser activo) durante 1 minuto a 400 xg y desechar el sobrenadante. </li><li> Lavar pellet más tres veces llenando el tubo con tampón M9. </li><li> Añadir 1 ml de buffer M9 de la pastilla, o poner los huevos a las placas de NGM no cabezas de serie, y se incuba a la temperatura deseada con una suave agitación. Aireación adecuada debe ser suministrada (Fig. 4). </li></ol> CONSEJOS: <ul><li> Existen diferentes soluciones blanqueadoras, elegir la que funciona mejor en sus manos (Tabla 1, Fig. 1). </li><li> Los huevos ya establecidos en las placas pueden ser recuperados por el desguace de la superficie del agar con un material blando tal como un trozo de una película de rayos-X. </li><li> Demasiados restos de los animales adultos puede afectar a la sincronización, ya que constituyen una fuente de alimento para las larvas recién eclosionadas. </li><li> Las altas temperaturas ligeramente acelerar el desarrollo, que es un inconveniente if cualquier salta gusano de sincronización debido a la diferencia en el desarrollo entre los gusanos sincronizados y sin sincronizar será mayor a temperaturas más altas. </li><li> Solución de blanqueo debe realizarse justo antes de su uso. Además, el cloro pierde su potencia después de haber sido abierta por un tiempo, en parte debido a su fotosensibilidad. Sugerimos alícuota de cada nueva botella en botellas de color ámbar pequeños para evitar tal pérdida y minimizar la exposición a la luz. </li></ul> 3. Protocolo C: Revestimiento Gusano <ol><li> Esperar entre 12 y 24 horas (tiempo para completar el desarrollo embrionario depende de la temperatura) después del blanqueo se realizó y recuperar gusanos por centrifugación (2 minutos a 400 xg). </li><li> Descartar el sobrenadante, las semillas de gusanos en las placas necesarias y dejar que el líquido residual seco. </li><li> Colocar las placas a la temperatura requerida. </li></ol> CONSEJOS: <ul><li> Larvas L1 en M9 tampón puede mantenerse a 15 ° C balanceo al menos durante una semana wiThout alteraciones evidentes. </li><li> tenga cuidado en el cálculo de los gusanos que servirán para comenzar porque muchos se agotan los alimentos más rápido de lo esperado y la ruina de su experimento. Aproximadamente 500 L1 puede llegar a la edad adulta en una placa de 55 mm sin el funcionamiento de los alimentos. </li></ul> 4. Protocolo D: C. elegans Observación D.1 Nomarski la observación Interferencia diferencial microscopía de contraste es una técnica de microscopía óptica de iluminación utilizado para mejorar el contraste en muestras no teñidas transparentes. La palabra se refiere a Nomarski el prisma utilizado, el nombre de su inventor. Mediante la observación de los animales vivos que son capaces de estudiar la fisiología del animal con las únicas alteraciones derivadas de la inmovilización. Además, como fijador se añade, marcadores fluorescentes se puede observar en vivo. Este hecho y la posibilidad de marcadores fluorescentes a la fusión de un gen de interés que sea factible para seguir los procesos en which la proteína de estudio pueden estar involucrados. Mediante el uso de la técnica descrita en este protocolo, no sólo gusanos vivos se puede observar, pero también pueden ser recuperados y se colocaron de nuevo. Agar preparación de la almohadilla (justo antes de su uso): <ol><li> Preparar agarosa al 2% en agua y se funden. Mantenga funde a 65 ° C. </li><li> Coloque dos diapositivas con un trozo de cinta en ellos a ambos lados de una tercera diapositiva, limpio. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur lugar una caída de agar sobre la superficie limpia. </li><li> Cubrir el agar con otro portaobjetos limpio colocado en la parte superior de las tres diapositivas perpendicularmente. </li><li> Presione suavemente por lo que la caída de agar se aplana al grosor de los separadores de cinta. </li><li> Una vez que el agar se solidifica, tire suavemente de las diapositivas pegados y separar las dos diapositivas restantes deslizando una respecto a la otra. </li></ol> Montaje animales vivos <ol start="7"><li> Azida Ponga una gota (10 l), 1 mM de levamisol o sodio 10-30 mM en tl Centro de la almohadilla. </li><li> Trasladar a los animales dentro de la gota con una selección de gusano. </li><li> Con suavidad, coloque un cubreobjetos sobre los animales y fijarlo a ambos lados con un poco de esmalte de uñas o de silicona. </li></ol> CONSEJOS: <ul><li> Mantener las alícuotas de agarosa al 2% a 4 ° C. </li><li> Agarosa fundida puede mantenerse a 65 ° C durante al menos un día. </li><li> Nota: El levamisol es un agonista del receptor nicotínico que provoca parálisis muscular espástica 16. </li><li> Tenga cuidado, azida de sodio es extremadamente tóxico! </li></ul> D.2 etanol fijación y DAPI El protocolo descrito aquí representa una forma rápida de teñido con DAPI gusanos, sin embargo, debido a la desecación del gusano algunas estructuras pueden presentar alguna alteración. Hay varios otros métodos para fijar los gusanos anteriores a DAPI tales como la fijación con solución de Carnoy o formaldehído que conservar mejor la integridad del gusano 17. La fijación de etanol (modificado a partir de 18) <ol><li> Lugar ~ 10 l de tampón M9 (o agua) en un portaobjetos de microscopio. </li><li> El uso de un gusano de escoger cuidadosamente la transferencia 10-25 gusanos a la caída. </li><li> El uso de papel de filtro o una micro-pipeta eliminar tampón M9 tanto como sea posible sin quitar los gusanos o dejando que se sequen. </li><li> Añadir aproximadamente 10 l de etanol al 90% y dejar secar. </li><li> Repita el paso 4 una o dos veces. </li></ol> 4 &#39;,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) tinción <ol start="6"><li> Mezclar DAPI con los medios de montaje deseada a una concentración final de 2 ng / l. </li><li> Una vez que el etanol se ha evaporado por completo, añadir 7 l de la DAPI: mezcla de medios de montaje. </li><li> Coloque un cubreobjetos y fijarlo a ambos lados con un poco de esmalte de uñas o de silicona. Las diapositivas estará listo para la observación de aproximadamente 5 minutos después de la adición de DAPI. </li></ol> CONSEJOS: <ul><li> El montaje de medicinaentre otras cosas contiene glicerol, por lo que una pequeña cantidad es suficiente para cubrir toda la preparación. </li><li> Existe una amplia variedad de medios de comunicación comerciales de montaje (Fluoromount o prolongar, por ejemplo), su calidad y el precio dependerá de cuánto tiempo desea almacenar la muestra. </li><li> Tenga cuidado, DAPI es un mutágeno conocido que se une fuertemente a regiones ricas en AT en el ADN. </li></ul> Recetas Nematodo medio de crecimiento (NGM) 1,7% (w / v) de agar 50 mM de NaCl 0,25% (w / v) peptona 1 mM de CaCl 2 5 ug / ml de colesterol 25 mM de KPO 4 1 mM de MgSO 4 M9 de amortiguación 22mm KH 2 PO 4 42 mM Na 2 HPO 4 86 mM de NaCl 1 mM de MgSO 4 Soluciones para blanquear a prueba <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td> Receta # 1 </td><td> Receta # 2 </td><td> Receta # 3 </td><td> Receta # 4 </td><td> Receta # 5 </td></tr><tr><td> agua (ml) </td><td> 2,75 </td><td> 3.5 </td><td> 0.5 </td><td> 0.5 </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> hidróxido de sodio (ml) </td><td> 1,25 (1M) </td><td> 0,5 (5M) </td><td> 2,5 (1M) </td><td> 2,5 (2M) </td><td> 2,5 (1M) </td></tr><tr><td> ~ de hipoclorito de sodio al 4% (ml) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> total (ml) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tabla I. Diferentes recetas de blanqueo de soluciones probadas para este artículo. Recetas # 3 y # 4 son 2x, y debe ser añadido al mismo volumen de M9. Recetas para el # 1, # 2 y # 5 han sido previamente reportados 2, 11, 19. Las concentraciones finales: # 1 de NaOH 0,25 M, ~ de hipoclorito de sodio al 0,8%<html> , N º 2 de NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%, n º 3 de NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, n º 4 de NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, n º 5 de NaOH 0,5 M, NaOCl ~ 0,8%. 5. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Comparación de los cinco diferentes soluciones de blanqueo en dos diferentes tiempos de incubación. Gusanos N2 se lavó dos veces con M9 se dividieron en cinco tubos de 15 ml cónicos que contienen cada una solución de blanqueo. Los tubos se agitaron vigorosamente y 1 ml transfirió a un tubo nuevo con M9 para detener la reacción después de que el tiempo especificado. Después de decoloración de los gusanos procedimiento se incubaron con 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. En cada caso, inferior fotografía fue tomada justo después del blanqueo, fotografía superior 24 horas después. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Temperatura de solución de blanqueo afecta a la eficacia del tratamiento. Volúmenes iguales de gusanos N2 se blanquearon con la misma solución de blanqueo ya sea previamente enfriada en hielo durante 20 minutos o se mantiene a 25 ° C durante el mismo tiempo. Las dos columnas de las imágenes muestran a la izquierda justo después del blanqueamiento. Después de gusanos de tratamiento se incubaron en tubos cónicos de 15 ml con 1 ml de M9 a 20 ° C durante 24 horas. Las columnas en los cuadros de la exhibición correctas las 24 horas posteriores. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. El gusano relación sedimento: tiempo de incubación hipoclorito alcalino afecta a la eficacia del tratamiento l 50, 100, 250 y 500 de gusano sedimento se incubaron con 2 ml de solución de blanqueo # 3 minutos para 3, 6 y 9.. Sombreadas L1, embriones muertos y restos de fragmentos adultos fueron cuantificados después de incubación a 20 ° C durante 2<html> 4 horas en tubos de 15 ml cónicos con 1 ml de tampón de M9. Aproximadamente tres placas confluentes de 55 mm con gusanos adultos son necesarias para obtener una pastilla 100 l gusano. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ventilación adecuada es necesaria para la eclosión y la supervivencia de C. embriones elegans. Un pellets 100 l de gusanos N2 se blanquearon durante 6 minutos y se incubaron en tubos cónicos de 15 ml con 1 ml, 5 o 10, según se especifica, de M9 a 20 ° C durante 24 horas. La parte superior de la figura muestra fotografías de los cultivos después de 24 horas, donde las flechas indican los huevos que no eclosionan. En la parte inferior, hay un gráfico que representa la cantidad de larvas (gris claro) y los embriones muertos (gris oscuro) 48 horas después de la decoloración en las condiciones establecidas. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;alt =&quot; Figura 5 &quot;/&gt; Figura 5. Ciclo de vida de C. elegans. una. Duración aproximada de los gusanos en las diferentes etapas. Horas requerida para alcanzar cada etapa en función de la temperatura (modificado de 20). B. Nomarski (arriba) y DAPI (hacia abajo) imágenes de gusanos diferentes en las etapas de desarrollo indicadas. Las características más significativas de cada fase se multiplican L1: la flecha indica que los precursores de la gónada somáticas y la línea germinal temprana L4: negro flecha (Nomarski) indica que el desarrollo de la vulva; flechas blancas (DAPI) indican que los dos brazos gonadales Medio... finales de L4: La flecha indica la vulva en desarrollo en la etapa de árbol de los llamados jóvenes adultos: la Navidad. flecha de color negro indica un embrión dentro del útero, punta de flecha apunta a la espermateca, flecha blanca indica un ovocito grávidas adultos:. punta de flecha (DAPI) señala embriones fecundados. Flecha en DAPI imagen indica espermateca. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Vulva morfología en L3, L4 y etapas adultas. En la etapa L3 sólo un lumen pequeño donde se forma la vulva puede ser observado. En L4, esta luz se expande formando el llamado &quot;árbol de Navidad&quot;. En el adulto la vulva ya está cerrado. Las líneas amarillas indican la localización de la vulva en estas tres etapas. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. DAPI en L3, L4 temprana, las etapas finales de L4 y adultos. En L3, línea germinal es alargada. A nivel L4, las gónadas de armas presentes en forma de U morfología. En los espermatozoides última etapa-L4 se puede observar en la parte distal de la gónada. Los adultos jóvenes presentan ovocitos. La línea germinal de adultos presenta ovocitos y embriones. Las líneas amarillas delimitar las líneas germinales en THe las distintas etapas establecidas. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. C. desarrollo elegans a los 15 y 25 ° C. gusanos N2 se blanquearon, se incubaron durante la noche en M9 y agitación a 15 ° C, se transfirió a placas y se cultivaron los tiempos indicados en las temperaturas indicadas.

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No tenemos nada que revelar.

Sincronización de los nematodos Varias soluciones de blanqueo se han descrito. Probamos cinco recetas diferentes (Tabla I) y, en nuestras manos, no muestran diferencias significativas en la sincronización de las poblaciones de gusano (Fig. 1). Sin embargo, nuestros experimentos mostraron que los parámetros tales como temperatura (Fig. 2), la solución de blanqueo relación: volumen de gusanos (Fig. 3) y el volumen de M9 con ...

basic caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation

La investigación sobre la biología molecular y del desarrollo de los nematodo Caenorhabditis elegans se inició en los años setenta por Sydney Brenner y desde entonces ha sido utilizado ampliamente como un organismo modelo 1. C. elegans posee atributos clave tales como la simplicidad, la transparencia y el corto ciclo de vida que han hecho un adecuado sistema experimental para estudios biológicos fundamentales desde hace muchos años 2. Los descubrimientos en este nematodo tener amplias implicaciones debido a que muchos procesos celulares y moleculares que controlan el desarrollo evolutivo de los animales son conservadas 3. C. elegans ciclo de vida pasa por una fase embrionaria y cuatro estadios larvarios antes que los animales alcanzan la edad adulta. El desarrollo puede tomar de 2 a 4 días dependiendo de la temperatura. En cada una de las varias etapas rasgos característicos pueden ser observadas. El conocimiento de su linaje celular completo, junto con el 4,5 annotat profundaión de su genoma convertir este nematodo en un gran modelo en campos tan diversos como la neurobiología 6, el envejecimiento de 7,8, 9 biología de células madre y la biología de la línea germinal 10. Una característica adicional que hace C. elegans un modelo atractivo para trabajar con la posibilidad de la obtención de las poblaciones de gusanos sincronizados en una etapa específica a través de un protocolo relativamente fácil. La facilidad de mantenimiento y propagación de este nematodo añadido a la posibilidad de sincronización proporcionar una poderosa herramienta para obtener grandes cantidades de gusanos, que pueden ser utilizados para una amplia variedad de experimentos pequeños o de alto rendimiento, tales como pantallas de RNAi, micromatrices, secuenciación masiva, inmunotransferencia o la hibridación in situ, entre otros. Debido a su transparencia, C. estructuras elegans pueden distinguirse bajo el microscopio de interferencia diferencial utilizando microscopía de contraste, también conocido como micros Nomarskicopiar. El uso de un ligante de ADN fluorescente, DAPI (4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol), por ejemplo, puede conducir a la identificación específica y localización de las células individuales, así como las estructuras subcelulares y defectos asociados a ellos.

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Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

La facilidad de mantenimiento y propagación del nematodo<em&gt; C. elegans</em&gt; Lo convierten en un organismo modelo agradable trabajar con él. La posibilidad de que los gusanos de sincronización permite el trabajo con una gran cantidad de temas en la misma etapa de desarrollo, lo que facilita el estudio de un proceso en particular en muchos animales.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

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Biology

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

46.2K vistas.  Bellvitge Institute for Biomedical Research. La facilidad de mantenimiento y propagación del nematodo C. elegans Lo convierten en un organismo modelo agradable trabajar con él. La posibilidad de que los gusanos de sincronización permite el trabajo con una gran cantidad de temas en la misma etapa de desarrollo, lo que facilita el estudio de un proceso en particular en muchos animales.

Video: Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Investigación

Biología

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

Vampiric Aislamiento de líquido extracelular de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Extracción y análisis de prostaglandina en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH) con sondas de PNA en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Nucleótido y extracciones de proteínas de Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

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Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans

Vampiric Aislamiento de líquido extracelular de

Extracción y análisis de prostaglandina en

La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia

Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

Nucleótido y extracciones de proteínas de Caenorhabditis elegans

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans