Este trabajo fue apoyado por el NIH R01 HG002995 &quot;cultivar el pez cebra genoma: un enfoque inverso Genética&quot; de CBM.

Parte A: Soluciones de congelar el semen 1. Ginsberg timbres de pescado (fresco hacer cada 3 días; Ginsburg, 1963) NOTA: el orden de adición ES IMPORTANTE para prevenir la precipitación En 450 ml de agua estéril ddH2O disolver: <ul><li> NaCl 3,25 g </li><li> KCl 0,125 g </li><li> • 2 H2O CaCl2 0,175 g A continuación, añadir: </li><li> NaHCO3 0,10 g </li></ul> Alcanzar un volumen final de 500 ml con ddH2O estéril y se almacenan a 4 ° C. 2. Medio de congelación (Haga fresco todos los días) <ol style="list-style-type:lower-roman"><li> SIN metanol <ul><li> Pescado Ginsburg Ringers 10 ml (temperatura ambiente). </li><li> Leche descremada en polvo 1,5 g </li></ul></li><li> Con metanol NOTA: el orden de adición ES IMPORTANTE para prevenir la precipitación <ul><li> Pescado Ginsburg Ringers 9 ml (temperatura ambiente). </li><li> 1 ml de metanol </li><li> Leche descremada en polvo 1,5 g </li></ul> Después de montar los medios de congelación, se mezcla bien durante 20 minutos. en un agitador orbital o una mecedora. Antes de usar, alícuota de 1 ml en tubos eppendorf, evitando las burbujas de la superficie. </li></ol> Parte B: Material necesario para la congelación de los espermatozoides Materiales necesarios para la congelación de los espermatozoides <ol><li> 10 pipetas desechables l (gato Fisherbrand # 22 a 358.697) </li><li> Vasos de 250 ml para los peces de agua que contiene MESAB / tricaína </li><li> Vidrios de reloj (gato Pyrex # 9985-75) </li><li> P20 Pipetman (o equivalente) y consejos </li><li> Esponja titular de los peces (para mantener hombres al momento de apretar) </li><li> Microscopio de disección con la iluminación del escenario por encima de </li><li> Pinza plana (por ejemplo, tipo Millipore) </li><li> 2,0 ml viales criogénicos (Corning cat # 430488) </li><li> 10X10 Cajas criogénicas (Nalgene gato # 03-337-7AA) </li><li> Espuma de poliestireno recipiente con unos 15 cm de ICE1 finamente molidas en seco </li><li> 15 ml tubos cónicos (Falcon # 352099) </li><li> Dewar frasco que contiene nitrógeno líquido </li><li> Pinzas largas (por ejemplo, CMS Fisher gato Cuidado de la Salud # 10-316B) </li><li> Cryogloves </li><li> Tanque de recuperación para los hombres </li><li> Un tubo eppendorf llena de medios de congelación sin metanol </li><li> Un tubo eppendorf llena de medios de congelación con metanol </li><li> Cryofreezer (por ejemplo, Taylor-Warton K-series) </li></ol> 1 Un método simple para la fabricación de hielo seco finamente triturada es envolverlo en una toalla y pulverizar con un martillo. Un método más eficiente es el uso de un molino de hielo seco, por ejemplo, el modelo Clawson RE-2. Parte C: Método de congelación de esperma <ol><li> MARK tubos capilares: Antes de comenzar, marcar los tubos capilares 10μl con una pluma de laboratorio en el nivel de 3,33 l (es decir, 16,7 mm de fondo, véase la Fig. 1.1.). </li><li> Anestesiar MASCULINO: masculino Lugar (s) en el vaso que contiene MESAB / tricaína diluido en agua de pescado (ver receta en &quot;El Libro de pez cebra&quot;) </li><li> Secar el pescado: Una vez anestesiado, levantar un pez fuera del anestésico con una cuchara de plástico y suavemente pescado seco en una toalla de papel, prestando especial atención al secado de la parte ventral. El agua activa el esperma lo que es importante que se seque completamente alrededor de la cloaca. Posición de los peces en el titular de la esponja, hasta la parte ventral (Fig. 1.2). Si la región alrededor de la aleta anal está todavía húmeda, ligeramente seco, con una Kimwipe. Tenga cuidado de no apretar el esperma antes de tiempo! </li><li> Lugar marcado en el tubo capilar adaptador de goma pipetear con la boca que se incluye con los tubos capilares. El adaptador es un tubo de goma que tiene una boquilla en un extremo y un soporte capilar en el otro. Alternativamente, el tubo capilar puede ser conectado a una jeringa Hamilton 50μl a través de un pequeño trozo de tubo Tygon con el diámetro apropiado. </li><li> Lugar en el ámbito masculino y exponer la apertura urogenital con cuidado la difusión de las aletas pélvicas separadas usando el extremo del tubo capilar. </li><li> Juntar esperma: expulsar esperma por acariciar suavemente los lados del pescado con unas pinzas suaves (por ejemplo, Millipore), o apretando suavemente los lados de los peces entre el dedo índice y el pulgar. Recoger los espermatozoides en un tubo capilar, ya que es expulsado con una suave succión (Fig. 1.2). Evitar que las heces pueden ser expulsados ​​con el esperma. </li><li> Normalizar el volumen de esperma A l 3.3: Si el volumen de esperma alcanza o sobrepasa la marca pluma en tubo capilar (es decir, 16,7 mm o más), continúe con el paso 8. Si el volumen de esperma no llegue a volumen de destino, normalizar el volumen de la marca pluma usando Medio de congelar sin metanol (Fig. 1.3). Mínima cantidad de esperma que es aceptable varía con la calidad de los espermatozoides. Espermatozoide bueno es blanco y opaco. Pobre de la esperma se ve aguada. En general, se acepta como mínimos: 1 l de esperma bien (o 1 / 3 de destino) y 2 l de esperma pobres (o 2 / 3 de destino). Volumen se ha normalizado a 3,3 l. </li><li> AÑADIR crioprotector a los espermatozoides: Aspire medio de congelación con Metanol para la marca naranja (aprox. volumen total es ahora de 20 l;. Figura 1.4). Expulsar a la mezcla de esperma y crioprotector en la zona limpia de un vidrio de reloj, con especial atención a no introducir burbujas. Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo ~ 4 veces (evitar la introducción de burbujas). </li><li> LUGAR 10μl esperma en cada uno de 2 crioviales: Introducir 10 l de los espermatozoides: la solución de crioprotectores en la parte inferior de dos crioviales separadas que han sido etiquetados con la información relevante (Figura 1.5). Moviéndose rápidamente, los viales de la tapa y colóquelos en la parte inferior de la temperatura ambiente de 15 ml tubos Falcon, uno criovial / tubo. Cap Falcon tubo e insertar el par de criovial que contienen los tubos Falcon en hielo seco triturado. </li><li> Congelar el esperma durante 20 minutos. En hielo seco: El hielo seco debe ser en forma de polvo fino, no pellets. Los tubos se insertan en el hielo seco lo suficientemente profundo que sólo muestran sus límites (Fig. 1.6). Con el fin de realizar un seguimiento de los tubos en hielo seco, dar a cada par de tubos Falcon de un número de 1-20 (escrita en las tapas) y registrar el momento en que entra en el hielo seco. </li><li> LUGAR crioviales en nitrógeno líquido:. Después de que el esperma ha sido congelado en hielo seco durante 20 minutos, transferirlos a un átomo de nitrógeno líquido que contiene frasco de Dewar. Los espermatozoides se almacenan aquí hasta el momento de colocar en el congelador de nitrógeno líquido. Al colocar en las cajas del congelador, coloque el cuadro congelador en un baño de nitrógeno líquido para que las muestras no se calientan. Utilice pinzas largas de metal para recuperar frascos de vaso Dewar y manejar con cryogloves. Por otra parte, crioviales se pueden transferir directamente de hielo seco en el congelador si el congelador se mantienen sumergidas en nitrógeno líquido en un recipiente de espuma de poliestireno. </li><li> Crioviales almacenar a largo plazo en un congelador de nitrógeno líquido criogénico. Para mantener la viabilidad de los espermatozoides, es importante que los viales se almacenan sumergidos en nitrógeno líquido. En nuestra experiencia, los frascos almacenados en la fase de vapor pierden su viabilidad en el tiempo. La velocidad es importante! El tiempo entre la adición del crioprotector y la colocación de los viales de esperma en hielo seco (es decir, los pasos 6-10) no debe ser mayor de 30 seg. </li></ol> Parte D: En el método de fertilización in vitro con esperma criopreservados Nos parece que esto funciona mejor con dos personas. Una persona aprieta los huevos de las hembras, mientras que la otra persona se descongela el semen. <ol><li> Establecer un baño de agua a 33 ° C. </li><li> Quitar criovial del congelador de nitrógeno líquido y la transferencia de nitrógeno líquido que contiene frasco Dewar hasta que esté listo para descongelar. </li><li> Apriete los huevos de las hembras en el plato de plástico de 35 mm de Petri. Si es posible, tratar de obtener tres nidadas de huevos y se combinan en un plato. Si usted no puede conseguir tres garras bien dentro de 1 minuto de su primera nidada, a continuación, proceder al paso 4 (un embrague bueno es suficiente). Definición de embrague bien:&gt; 150 huevos en busca de manera uniforme bonito (amarillo, es decir, sin residuos blancos indicador de una degradación). Mantenga plato cubierto mientras que el esperma descongelado. </li><li> Retire el vial de nitrógeno líquido y se quite la tapa. Vial rápidamente sumergirse ~ 1 / 2 camino a 33 ° C baño de agua de 8.10 seg. </li><li> Añadir rápidamente a temperatura ambiente 70 l Hanks al vial y mezclar pipeteando arriba y hacia abajo. Inmediatamente agrega a los huevos y mezclar suavemente con la punta de la pipeta. </li><li> Sin demora, activar esperma y los óvulos mediante la adición de 750 peces de agua l. Agitar para mezclar. Incubar 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Después de 5 minutos, llenar con agua los peces plato y plato se incuba a 28 ° C. Después de 2-3 horas, el recuento y la transferencia de embriones fértiles a los platos de 100 mm (50/dish). Conteo de huevos infértiles para que la frecuencia de fertilización se puede determinar. </li><li> Tenga mucho cuidado de las larvas! Durante los primeros 5 días, el cambio diario del agua y eliminar embriones muertos. Ponga las larvas sólo tienen vejigas natatorias en vivero en el día 5. </li></ol> Parte E: Resultados Representante Hemos utilizado esta metodología crypreservation para hacer una biblioteca de 8.600 muestras de semen congelado para la labranza, entre los años 2001 y 2003. Hemos descongelado 106 de estas muestras y se determinó su fertilidad. La fertilidad es la proporción de embriones viables producidos en una fertilización in vitro, dividido por el número total de huevos que fueron fecundados con el esperma congelado. Fresco (no cryporeserved) esperma normalmente tiene la fertilidad&gt; 95%; espermatozoides criopreservados ha fertilidad mucho más baja: un promedio de 29% (n = 106 viales). La variabilidad de vial a vial de la fertilidad es muy grande, que van desde menos del 1% hasta un máximo de 62%. Esta variabilidad está representada por las barras de error grande que representa la desviación estándar de la figura. 2. Sin embargo, en 106 muestras de semen descongelado hasta la fecha sólo hemos experimentado una vez la fertilidad del 0% en las muestras de esperma de ambos y no logró recuperarse de la mutación labranza correspondiente. Por el deshielo frascos de esperma de la biblioteca a lo largo de varios años (2001-2008) se ha encontrado que el promedio de fertilidad de las muestras de esperma congelado por este método sigue siendoestable en el tiempo (Fig. 2). La fecundidad promedio de las muestras de esperma congelado se descongela en 2001 fue del 23,5% (basado en 11 muestras de semen) y en 2008 fue del 25% (basado en 21 muestras de semen). Un número de otros investigadores están usando este protocolo de congelación de esperma en sus laboratorios. Algunos han reportado buenos resultados con las tasas de fecundidad y la variabilidad de la muestra a la muestra similar a lo que hemos observado. Otros no han logrado convencer para que este protocolo de trabajo en sus manos. Creemos que las posibles fuentes de problemas son: <ol><li> Si no se utiliza la crioviales exacta o tubos cónicos que hemos sugerido en el protocolo, lo que lleva a un ritmo diferente de la hipotermia cuando en hielo seco; </li><li> Si no se utiliza hielo seco en polvo, dando lugar a una velocidad de enfriamiento debajo del nivel óptimo; </li><li> Utilizando los peces machos de baja fertilidad: usted debe obtener al menos 1 l de esperma de un macho. También puede probar la fertilidad masculina haciendo una fertilización in vitro con semen fresco, sin embargo esto puede ser engañoso ya que tiene muy poco semen fresco para obtener casi el 100% de fertilidad. </li><li> Utilizando debajo de los estándares de calidad en los huevos de la fecundación in vitro. Usando nada más que perfecto garras siempre lleva a cerca de 0% de fertilidad, aunque a partir de muestras de semen que en realidad tienen una buena fertilidad (sobre la base de la fertilidad del vial duplicado). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquema de la metodología de congelar el semen. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Fertilidad del semen criopreservadas se mantiene estable en el tiempo. Fertilidad por ciento es el número de embriones viables producidos en una fertilización in vitro, dividido por el número total de huevos que fueron fecundados con el esperma congelado. &quot;N&quot; se refiere al número de viales de semen crioconservado cuya fertilidad ha sido probado en el año correspondiente. Las barras de error representan la desviación estándar. Dado que cada vial de esperma es de un hombre diferente, vial a vial variabilidad que se observa.

<ol>
	<li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes.">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li><li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol.">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li></ol>

Un número de otros investigadores están usando este protocolo de congelación de esperma en sus laboratorios. Algunos han informado de la fertilidad similar y la misma muestra de la muestra de la variabilidad que hemos observado. Otros no han logrado convencer para que este protocolo de trabajo en sus manos. Creemos que las posibles fuentes de problemas son: <ol><li> Si no se utiliza la crioviales exacta o tubos cónicos que hemos sugerido en el protocolo, lo que lleva a un ritmo diferente de la hipotermia cuando en hielo seco; </li><li> Si no se utiliza hielo seco en polvo, dando lugar a una velocidad de enfriamiento debajo del nivel óptimo; </li><li> Utilizando los peces machos de baja fertilidad: usted debe obtener al menos 1 l de esperma de un macho. También puede probar la fertilidad masculina haciendo una fertilización in vitro con semen fresco, sin embargo esto puede ser engañoso ya que tiene muy poco semen fresco para obtener casi el 100% de fertilidad. Más grandes, los machos con mayor fuerza de color suelen dar más espermatozoides de mayor calidad. </li><li> Utilizando debajo de los estándares de calidad en los huevos de la fecundación in vitro. Usando nada más que perfecto garras siempre lleva a cerca de 0% de fertilidad, aunque a partir de muestras de semen que en realidad tienen una buena fertilidad (sobre la base de la fertilidad del vial duplicado). </li></ol>

<table><tbody><tr><td>10 &amp;mu;l disposable pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-358697</td><td></td></tr><tr><td>Watch glasses</td><td>Pyrex</td><td>9985-75</td><td></td></tr><tr><td>2 ml cryogenic vials</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>10 x 10 cryoboxes</td><td>Nalge Nunc international</td><td>03-337-7AA</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Falcon BD</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Tongs</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316B</td><td></td></tr><tr><td>Cryofreezer</td><td>Taylor-Wharton</td><td>K-series</td><td>For example</td></tr></tbody></table>

a high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization

Este es un método para la crioconservación de esperma de pez cebra que es una adaptación del método de Harvey (Harvey et al., 1982). Hemos introducido dos cambios en el protocolo original que tanto simplificar el procedimiento y la uniformidad de la muestra aumenta. En primer lugar, normalizar todos los volúmenes de los espermatozoides utilizando medios de congelación que no contiene el crioprotector. Espermatozoides en segundo lugar, se almacenan criopreservadas en crioviales en lugar de los tubos capilares. Las tasas de congelación y descongelación de espermatozoides (δ ° C / hora) son probablemente las dos variables más importantes para el control de este procedimiento. Por esta razón, no pueden sustituir los tubos diferentes a los especificados. Trabajando en equipos de 2, es posible congelar el esperma de 100 hombres por equipo en ~ 2 hrs. Espermatozoides criopreservados utilizando este protocolo tiene un promedio de 25% de la fertilidad (medida como el número de embriones viables generado en una fertilización in vitro, dividido por el número total de huevos fecundados) y esta fertilidad por ciento es estable durante muchos años.

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A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Este es un protocolo de esperma de alto rendimiento para la criopreservación de pez cebra. Espermatozoides criopreservados utilizando este protocolo tiene un promedio de 25% de la fertilidad en la fertilización in vitro posterior y es estable durante muchos años.

Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

30.9K vistas.  University of California, Davis. Este es un protocolo de esperma de alto rendimiento para la criopreservación de pez cebra. Espermatozoides criopreservados utilizando este protocolo tiene un promedio de 25% de la fertilidad en la fertilización in vitro posterior y es estable durante muchos años.

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Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Investigación

Genética

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biología del Desarrollo

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

La manipulación de ploidía de embriones de pez cebra con el Heat Shock Treatment 2

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Detección de espermatozoides para el aislamiento rápido de ediciones de la línea germinal en el pez cebra

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Hacer pez cebra Gynogenetic diploides por presión inicial

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Biología

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separación de células foliculares y ocitos en folículos ováricos de pez cebra

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilización

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a model for human diseases. Gene function study is based on the detection of gene expression patterns. Although immunohistochemistry offers a powerful way to assay protein expression, the limited number of commercially available antibodies in zebrafish restricts the application of costaining. In situ hybridization is widely used in zebrafish embryos to detect mRNA expression. This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish embryo sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. Immunohistochemistry and the imaging of a single cryosection were performed after in situ hybridization. The protocol is helpful to unravel the expression pattern of two genes, first by in situ transcript detection and then by immunohistochemistry against a protein in the same section.

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

This protocol describes how to obtain images by combining in situ hybridization and immunohistochemistry of zebrafish embryonic sections. In situ hybridization was performed prior to cryosectioning, followed by antibody staining. It is useful to detect the expression patterns of two genes in zebrafish if there is a paucity of antibodies.

In situ Hibridación combinada con inmunohistoquímica en embriones crioseccionados de pez cebra

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Neurociencias

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...