Cultivo e imágenes de cortes tumorales organotípicos ex vivo de pseudomixoma peritonei a partir de muestras tumorales humanas resecadas

Describimos un protocolo para la producción, cultivo y visualización de cánceres humanos, que han hecho metástasis a las superficies peritoneales. Las muestras tumorales resecadas se cortan con un vibratomo y se cultivan en insertos permeables para aumentar la oxigenación y la viabilidad, seguidas de imágenes y análisis posteriores mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

El pseudomixoma peritonei (PMP) es una afección poco frecuente que resulta de la diseminación de un tumor primario mucinoso y la acumulación resultante de células tumorales secretoras de mucina en la cavidad peritoneal. La PMP puede surgir de varios tipos de cáncer, incluidos el apendicular, el ovárico y el colorrectal, aunque las neoplasias apendiculares son, con mucho, la etiología más común. La PMP es difícil de estudiar debido a su (1) rareza, (2) modelos murinos limitados y (3) histología mucinosa y acelular. El método presentado aquí permite la visualización e interrogación en tiempo real de estos tipos de tumores utilizando cortes organotípicos ex vivo derivados del paciente en una preparación donde el microambiente tumoral (TME) permanece intacto. En este protocolo, primero describimos la preparación de cortes tumorales utilizando un vibratomo y el posterior cultivo a largo plazo. En segundo lugar, describimos imágenes confocales de cortes tumorales y cómo monitorear las lecturas funcionales de viabilidad, imágenes de calcio y proliferación local. En resumen, las rebanadas se cargan con tintes de imagen y se colocan en una cámara de imágenes que se puede montar en un microscopio confocal. Los videos de lapso de tiempo y las imágenes confocales se utilizan para evaluar la viabilidad inicial y la funcionalidad celular. Este procedimiento también explora el movimiento celular traslacional y las interacciones de señalización paracrina en el TME. Por último, describimos un protocolo de disociación para cortes tumorales que se utilizarán para el análisis de citometría de flujo. El análisis cuantitativo de citometría de flujo se puede utilizar para pruebas terapéuticas de banco a cabecera para determinar los cambios que ocurren dentro del paisaje inmune y el contenido de células epiteliales.

El pseudomixoma peritonei (PMP) es un síndrome raro con una tasa de incidencia de 1 por millón de personas por año¹. La mayoría de los casos de PMP son causados por metástasis de neoplasias apendiculares. Dado que los ratones no tienen un apéndice similar al humano, modelar este tipo de cáncer sigue siendo extremadamente desafiante. Si bien la enfermedad primaria a menudo se puede curar mediante resección quirúrgica, las opciones de tratamiento para la enfermedad metastásica son limitadas. Por lo tanto, la razón para desarrollar este nuevo modelo de corte organotípico es estudiar la patobiología de PMP. Hasta la fecha, no hay modelos organoides apendiculares que puedan cultivarse perpetuamente; Sin embargo, un modelo reciente demostró ser útil para las pruebas farmacológicas de agentes terapéuticos e inmunoterapia². Como tal, hemos adaptado un sistema organotípico de cultivo de cortes, que se ha utilizado en otros tipos de cánceres humanos, como cerebro, mama, páncreas, pulmón, ovario y otros 3,4,5,6.

Además de las neoplasias apendiculares, la PMP ocasionalmente resulta de otros tipos de tumores, incluidos los cánceres de ovario⁷ y, en raras circunstancias, las neoplasias mucinosas papilares intraductales⁸ y el cáncer de colon⁹. Además, estos tumores tienden a crecer lentamente, con tasas de injerto pobres en modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX)^10,11. Dados estos desafíos, existe una necesidad insatisfecha de desarrollar modelos para estudiar esta enfermedad para comenzar a comprender la patobiología de PMP y cómo estas células cancerosas: son reclutadas a las superficies peritoneales, proliferan y escapan a la vigilancia inmune.

Mientras se cortan de la circulación vascular sistémica, los cortes tumorales contienen componentes celulares y acelulares, incluyendo la matriz extracelular, las células del estroma, las células inmunes, las células cancerosas, las células endoteliales y los nervios. Este microambiente semiintacto permite la investigación funcional de estos tipos de células, lo que es excepcionalmente ventajoso en comparación con los cultivos de organoides 3D, que consisten solo en células cancerosas¹². Si bien los cultivos de cortes organotípicos son ventajosos en algunos aspectos, también son inherentemente un enfoque basado en el bajo rendimiento, en comparación con los organoides 3D, que pueden expandirse y son adecuados para el cribado terapéutico de fármacos en investigación multiplexado^13,14,15. En el caso de PMP, no ha habido informes que documenten el establecimiento confiable y el paso perpetuo de organoides derivados de PMP¹⁶. Esto probablemente se deba a la naturaleza de crecimiento lento de las células tumorales derivadas de PMP, así como al bajo número de células epiteliales malignas que se encuentran dentro de estos tumores mucinosos. Dada la necesidad de desarrollar modelos para estudiar PMP, los cortes organotípicos son especialmente adecuados para estudiar esta enfermedad. Presentamos un protocolo para preparar, obtener imágenes y analizar PMP de especímenes humanos.

La desidentificación y adquisición de todos los tejidos se realizó bajo un protocolo aprobado por el IRB en la Universidad de California, San Diego.

1. Preparación de tejidos PMP humanos para procesamiento y cultivo de tejidos

1. Transporte de tejidos tumorales y microdisección
   1. Preparar los medios de transporte y cultivo: completar 10% (v/v) Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 1% Penicilina/Estreptomicina (Pen Strep).
   2. A la llegada del tejido y de acuerdo con un protocolo institucional aprobado por el IRB, transfiera los tejidos tumorales PMP a 35 platos con un diámetro de 6 cm que contengan DMEM completo.
   3. Micro-diseccionar regiones sólidas del tumor de cualquier mucina licuada usando un bisturí. Mientras que los nódulos de mucina incrustados dentro de porciones sólidas del tejido se pueden cortar, eliminan todas las regiones licuadas del tumor. Además de eliminar cualquier mucina licuada, o regiones de tejido altamente mucinoso, elimine cualquier tejido que sea difícil de cortar con un bisturí. Corte los nódulos de tejido en trozos más pequeños, de aproximadamente 1 cm³ de tamaño.
      NOTA: La obtención de nódulos tumorales limpios de mucina y ECM densa será esencial para el corte exitoso utilizando un vibratome. Como control de calidad, el tejido tumoral que llega al laboratorio de investigación es cortado primero por un patólogo, que posteriormente es distribuido por el biorepositorio de UCSD. Los donantes de tejidos que se someten a la citorreducción paliativa de la torta omental son casos óptimos para este protocolo dada una alta carga de enfermedad, lo que permite una mayor producción de rebanadas a partir de la mayor masa de disponibilidad de tejido para la investigación.
      PRECAUCIÓN: Trabajar con tejidos humanos requiere la certificación de nivel de bioseguridad 2 (BSL2). Consulte con la institución para obtener capacitación sobre los procedimientos BSL2.
2. Preparación de agarosa e incrustación de tejidos
   1. Prepare una solución al 5% de agarosa de bajo punto de fusión en PBS sin FBS el mismo día de la llegada del tejido. Preste mucha atención a la solución de agarosa, ya que tiende a hervir rápidamente.
      NOTA: La agarosa de bajo derretimiento es esencial para incrustar piezas de tejido. La agarosa de alto punto de fusión se solidificará a temperaturas más altas, reduciendo la viabilidad de las rodajas de tejido si se incrustan. Además, FBS en la solución de disolución hará que se formen precipitados.
   2. Colocar las piezas de tejido obtenidas en platos de 6 cm sin líquido. Coloque no más de 2-3 piezas por plato de 6 cm para que puedan retirarse como cubos de agarosa sin molestar ni tocar otros tejidos.
   3. Agregue la solución líquida de agarosa al 5% a platos de 6 cm que contengan las muestras tumorales de 1 cm³ . Agregue suficiente agarosa para cubrir el espécimen. Una vez añadidos, colocar los pañuelos incrustados en una nevera a 4 °C durante 30 min.
3. Montaje de muestras de tejido en el vibratomo
   1. Retire el agar solidificado del refrigerador y corte los cubos de agarosa ligeramente más grandes que el ancho del tejido con un bisturí.
   2. Aplique súper pegamento a la etapa de vibratomo y coloque suavemente el cubo de agarosa sobre el súper pegamento. Espere 1-2 minutos para que el pegamento se solidifique. En este punto, el cubo de agarosa con tejido debe fijarse al escenario.
   3. Fije la cuchilla al vibratomo y establezca el grosor deseado de la sección de tejido. Para obtener imágenes descendentes óptimas utilizando microscopía confocal, las secciones deben ser de aproximadamente 150 a 250 micras. Presione el botón Inicio y continúe con el corte del bloque de tejido de agarosa hasta que el tejido esté completamente cortado.
      NOTA: Si el tejido no se está cortando o se desprende del cubo de agarosa, considere incrustar el tejido en una concentración más alta de agarosa y recorte cualquier trozo de tejido adicional que pueda ser demasiado denso para cortar o se adhiera a la cuchilla de vibratomo.
4. Cultivo de cortes de tejido en insertos permeables
   1. Prepare una placa de inserción permeable para el cultivo agregando 2 ml de medios DMEM completos por encima y 3 ml por debajo de la membrana permeable.
   2. Levante suavemente las rodajas de tejido de la cámara de corte del vibratomo con un pincel delgado y coloque de dos a cuatro rodajas en platos de cultivo permeables que contengan medios DMEM completos. Después de 24 h, aspirar el medio con una pipeta y reemplazar el medio con medios de cultivo frescos.
   3. Cultivar las rodajas durante un máximo de 7 días a 37 °C/5% de_CO2, sustituyendo el medio cada 24 h. En este punto de tiempo, agregue controles para la destrucción celular (bortezomib) y quimioterapias comprobables con 5-fluoruracilo (5-FU) a los medios de cultivo para realizar la intervención farmacológica.
   4. Después de 7 días de cultivo, espere una pérdida de viabilidad de alrededor del 15% -25% en comparación con el punto de tiempo del día 0 (inmediatamente después del corte) en condiciones no tratadas con medicamentos (DMEM completo). Mida la viabilidad utilizando colorantes de viabilidad vivo-muerto como calceína AM (vivo) y yoduro de propidio (muerto).

2. Imágenes confocales de cortes de tejido humano vivo

NOTA: Una vez que se han preparado los cortes organotípicos del tumor, es esencial determinar la viabilidad del tejido para realizar un análisis posterior eficiente y optimizado. Dado que las muestras tumorales tienen un grosor de 150-250 μm, se recomienda encarecidamente la microscopía confocal o de dos fotones sobre los microscopios de campo amplio para determinar estudios in situ. La citometría de flujo también se puede utilizar para determinar la viabilidad y las poblaciones celulares (los métodos se encuentran a continuación). Sin embargo, la resolución espacial se pierde durante el análisis de citometría de flujo, y es probable que la viabilidad se subestime dada la necesidad de disociar los cortes tumorales por métodos mecánicos y químicos.

1. Preparación de reactivos y configuración experimental
   1. Coloque cortes tumorales para el análisis de imágenes confocales en un solo pocillo de una placa de 12 pocillos que contenga PBS con FBS al 1%. Para experimentos de imágenes de calcio, en lugar de PBS, incubar las rodajas en solución de calcio extracelular preparada de la siguiente manera: 125 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl₂, 25 mM HEPES, 0.1% BSA, pH 7.4, 3 mM glucosa, estéril filtrada. Prepare esta solución con antelación y almacénela hasta 1 mes a 4 °C (ver sección 2.1.8).
   2. Siguiendo las concentraciones y protocolos recomendados por el fabricante, tiñe las muestras con colorantes de imagen (ver Tabla de materiales) para determinar la viabilidad de los cortes de tejido. Imagen durante 10 min-1 h después de añadir el tinte de viabilidad.
   3. Después de la incubación, transfiera las rodajas a una placa de Petri ópticamente transparente con fondo de vidrio que contenga PBS con 1% de FBS para usarla para obtener imágenes en un dispositivo de imágenes confocales.
      NOTA: Para las imágenes confocales, se utilizó la plataforma Confocal Nikon A1R.
   4. Abra el software de imágenes confocales. Comience a crear imágenes a 10x y seleccione el modo de imagen XYZ. A continuación, configure los ajustes de adquisición de la siguiente manera.
      1. Encienda los siguientes láseres: 488 nm y 561 nm. Ajuste la ganancia a 100 con potencia láser al 1%. Ajuste la potencia del láser y gane según sea necesario durante la adquisición de imágenes. Dependiendo de la calidad de imagen deseada, seleccione 512 x 512 píxeles o 1024 x 1024 píxeles para una resolución más alta.
   5. Seleccione Quitar bloqueo y, a continuación, seleccione Escanear para iniciar la creación de imágenes.
   6. Para obtener imágenes de calcio, incubar rodajas de tejido con Fluo-4-AM durante 1 h protegido de la luz. Siga el protocolo del fabricante para disolver Fluo-4-AM en DMSO. Después de 1 h, lavar las rodajas 3 veces con solución de calcio extracelular y seguir el protocolo de imagen en los pasos 2.1.4-2.1.5.
   7. Para experimentos de imágenes de calcio con Fluo-4-AM, seleccione XYZT y anule la selección del láser de 561 nm para aumentar la velocidad de adquisición. Además, utilice el escáner de resonancia para aumentar aún más la velocidad de las imágenes.

3. Disociación de cortes vivos para citometría de flujo

NOTA: La disociación de cortes de tejido vivo se puede utilizar para varias aplicaciones posteriores, incluido el inmunotipado, la evaluación de la viabilidad y el interrogatorio de los cambios en las poblaciones celulares después de la intervención farmacológica. Se deben tomar medidas para garantizar que la calidad del tejido y la viabilidad celular se mantengan durante el proceso de disociación.

1. Corte una pieza pequeña del extremo de una punta de pipeta de 1 ml para ensanchar la abertura y permitir una disociación mecánica vigorosa pipeteando durante 1 min.
2. Incubar rodajas a 37 °C con rotación durante 5-15 min en 1 ml de tampón digestivo que consiste en DMEM de glucosa alta, 10% de colagenasa/hialuronidasa suave (GCH), 10% de FBS y 10% de DNaseI (1 mg/ml de stock).
   NOTA: A menudo se encuentran cambios de colagenasa/hialuronidasa dependientes de lotes.
3. Realice una interrupción vigorosa del tejido utilizando disociación mecánica 2-3 veces durante la incubación. Asegúrese de revisar la digestión, a ojo, cada 5 minutos para detectar evidencia de digestión completa. Si es necesario, detenga la digestión enzimática continuando con el paso 3.1.4.
4. Una vez digerido, pipetear las rodajas y los medios de digestión sobre un filtro de 70 μm colocado encima de un tubo cónico de 50 ml. Escoja piezas más grandes con pinzas estériles o una pipeta.
5. Usando el extremo posterior romo de una jeringa de plástico de 5 ml, triture cualquier rodaja no disociada más grande y lave más con 4 ml de PBS que contengan 2% de FBS.
6. Tome el sobrenadante celular disociado en un tubo cónico de 50 ml y gire a 300 x g durante 5-10 min. Retire el sobrenadante y lave el pellet con 1 ml de PBS que contenga 2% de FBS.
7. Para preparar la muestra para la citometría de flujo, añadir el tampón de bloqueo que contiene 50 μL de bloqueo Fc humano y dejar a temperatura ambiente durante 15 min. Realizar tinción extracelular utilizando los anticuerpos respectivos en 50 μL de PBS que contienen 2% de FBS.
   NOTA: Hay muchos sistemas de citometría de flujo. Una vez que la muestra esté preparada para la citometría de flujo, consulte el protocolo del fabricante para el funcionamiento del dispositivo.

4. Intervención farmacológica utilizando cortes de tejido vivo para análisis de viabilidad y proliferación

NOTA: Una vez que se han preparado los cortes organotípicos del tumor, se pueden realizar enfoques intervencionistas mediante el uso de varios métodos, incluidas las pruebas de drogas, el ARNsi, así como la infección viral de cortes de tejido vivo. Aquí discutiremos las pruebas de drogas, así como las lecturas funcionales posteriores, que incluyen el análisis de viabilidad utilizando la proliferación local.

1. Prepare 10 ml de DMEM completo al 10% v/v con 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1% de estreptococo de pluma.
2. Alícuota 5 mL de medio completo para condiciones de control y tratamiento. A los 5 ml restantes de medios, agregue bortezomib (2 μM) para inducir la muerte celular en cortes tumorales como control positivo.
   NOTA: Bortezomib, a altas concentraciones, es un fármaco citotóxico que induce la muerte celular. Los otros fármacos citotóxicos pueden utilizarse como control positivo para la destrucción celular.
3. Utilizando de dos a cuatro rodajas de tejido, que se han emplatado en las placas permeables, agregue al plato los medios preparados en el paso 4.2, así como cualquier terapia combinada adicional que se utilizará para el análisis VIVO/MUERTO de viabilidad posterior utilizando microscopía confocal como se describe en el paso 2.1.2, o use un análisis de viabilidad luminiscente comercial utilizando cortes emparejados secuencialmente.
   NOTA: La coincidencia secuencial de cortes es esencial para el análisis de viabilidad luminiscente, dado que el ensayo de viabilidad luminiscente se basa en el contenido de ATP celular. Como los controles internos se pierden durante la lisis celular, se requieren cortes de tamaño similar ya que los resultados dependen del número inicial de células viables (es decir, los cortes desequilibrados darán como resultado resultados desequilibrados). Si el usuario no obtiene cortes secuenciales, el análisis de viabilidad luminiscente no es posible y, como tal, se requerirá otro método de evaluación de viabilidad (citometría de flujo o análisis de células vivas basado en imágenes confocales).
4. Deje las rodajas de tejido en cultivo que contengan DMEM completo durante 2-5 días, cambiando los medios, así como bortezomib y 5-FU cada dos días.
5. Para el análisis de viabilidad luminiscente, agregue 500 μL de PBS en una placa de 12 pocillos y transfiera las rodajas de tejido secuencialmente emparejadas a la solución de PBS con un pincel o use la succión de una pipeta de 1 ml suavemente para transferirlas.
6. Retire el PBS y agregue la solución de análisis de viabilidad luminiscente que se preparó. Consulte el manual de instrucciones para la preparación del reactivo.
7. Añadir 500 μL de la solución de viabilidad luminiscente por condición e incubar con una rotación lenta en el agitador a temperatura ambiente durante 30 min. Lea la luminiscencia usando un lector de placas de luminiscencia.

En resumen, las muestras de tumores humanos de PMP se obtienen bajo un protocolo aprobado por el IRB. El tejido se prepara, se microdisecciona y se solidifica en un molde de agarosa para ser cortado con un vibratomo (Figura 1A; Video 1). Una vez cortados, los cortes de tejido se colocan y se cultivan en membranas de inserción permeables (Figura 1B), que se pueden utilizar para ensayos de imágenes in situ, así como para interrogación...

Este manuscrito describe una técnica que se puede utilizar para cultivar, interrogar y analizar muestras tumorales de pseudomixoma peritonei humano (PMP). Hemos utilizado numerosos ensayos funcionales posteriores para interrogar el microambiente inmune del tumor y una plataforma para pruebas de banco a cabecera.

Si bien el método es altamente eficiente en nuestras manos, requerirá algo de práctica para cortar muestras tumorales usando un vibratomo. Es decir, encontramos problemas que se de...

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los autores desean agradecer a Kersi Pestonjamasp del centro central de imágenes del Moores Cancer Center por su ayuda con la subvención 2P30CA023100 del Centro de Apoyo Especializado para el Cáncer P30 del Centro de Apoyo Especializado para el Cáncer de UCSD con los microscopios. Este trabajo fue apoyado adicionalmente por una subvención de publicación JoVE (JRW), así como generosas donaciones del patrimonio de Elisabeth y Ad Creemers, la Fundación de la Familia Euske, el Fondo de Investigación del Cáncer Gastrointestinal y el Fondo de Investigación de Metástasis Peritoneal (AML).