Der Schwerpunkt meiner Forschung liegt darauf, die kritischen Bestätigungsinformationen von Amyloid beta 1-40 zu erhalten, wenn es über die Oberfläche der Goldnanopartikel absorbiert wird und einen reversiblen Aggregationsprozess abläuft. Die Herausforderung, vor der wir in diesem Forschungsfeld stehen, besteht darin, thermische, chemische und dynamische Informationen über den Reverse-Aggregationsprozess zu erhalten. Die große Erkenntnis dieses Projekts ist, dass wir in der Lage sind, den speziellen Bewegungs- oder Vibrationsmodus zu identifizieren, der zur gefalteten oder ungefalteten Bestätigung von Amyloid beta 1-40 beiträgt, wenn sie über die Oberfläche der Goldnanopartikel absorbiert werden.
Der große Vorteil der Verwendung von SERS, der oberflächenverstärkten Raman-Streuspektroskopie, besteht darin, sehr kleine, schwache Streusignale zu detektieren, um die Mode zu identifizieren, die für die Faltung und Entfaltung entscheidend ist. Gleichzeitig sind wir in der Lage, die Morphologie der Zuschlagstoffe genau zu bestimmen. Die Erkenntnisse, die wir aus diesem Projekt gewinnen können, sind die Schlüsselinteraktion der Protein-Protein-Interaktion, die für die Entstehung des Oligomers wichtig sein wird und zur Fibrogenese führen wird.
Fügen Sie zunächst mit einer Mikropipette einen Milliliter destilliertes deionisiertes Wasser zu einem Milligramm lyophilisiertem Amyloid-Beta oder A beta 1-40 hinzu. Mischen Sie die Lösung mit einem Wirbelmischer etwa 30 Sekunden lang. Stellen Sie sicher, dass bei Raumtemperatur von ca. 20 Grad Celsius keine festen Partikel in der Lösung verbleiben.
Bereiten Sie anschließend Peptid-Stammlösungen mit deionisiertem und destilliertem Wasser vor. Bestimmen Sie die Peptidkonzentration durch spektroskopische Messung der Tyrosinabsorption bei 275 Nanometern. Lagern Sie die A beta 1-40 Stammlösungen bei minus 80 Grad Celsius.
Tauen Sie die Peptidstammlösung etwa fünf Minuten vor der Datenerfassung auf. Mischen Sie in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen acht Mikroliter der Peptidlösung mit 800 Mikrolitern kolloidalen Goldpartikeln. Fügen Sie 4,2 Milliliter deionisiertes destilliertes Wasser hinzu und wirbeln Sie die Probe 10 Sekunden lang ein.
Legen Sie die Konzentration von A beta 1-40-Peptiden auf 1,8 Nanomolar fest und passen Sie das Verhältnis von Peptiden zu kolloidalen Goldpartikeln innerhalb des spezifischen Bereichs an. Stellen Sie die Lösung mit dem Temperiergerät des Spektralphotometers für sichtbare UV-Strahlen auf Raumtemperatur von ca. 22 Grad Celsius ein. Überwachen Sie den anfänglichen pH-Wert der Probenlösung mit einem pH-Messgerät und stellen Sie ihn auf leicht unter pH sieben ein.
Erfassen Sie das Absorptionsspektrum im Bereich von 400 bis 800 Nanometern. Stellen Sie dann den pH-Wert der Probe auf ungefähr pH vier ein, indem Sie 1,0 Mikroliter in Schritten von 1,0 molare Salzsäure hinzufügen. Erfassen Sie das Absorptionsspektrum über den gleichen Bereich von 400 bis 800 Nanometern.
Stellen Sie als Nächstes den pH-Wert der Probe auf ungefähr pH 10 ein, indem Sie etwa 1,5 Mikroliter in Schritten von 1,0 molar Natriumhydroxid hinzufügen. Erfassen Sie das Absorptionsspektrum im gleichen Wellenlängenbereich von 400 bis 800 Nanometern. Ändern Sie danach den pH-Wert zwischen pH vier und pH 10 10 Mal, indem Sie entweder Salzsäure oder Natriumhydroxid hinzufügen.
Erfassen Sie kontinuierlich das Absorptionsspektrum bei 25 Grad Celsius. Rufen Sie den ASCII-Datensatz der Wellenlängen als Funktion der Absorption ab. Verwenden Sie das Programm "PeakFit", um die durchschnittlichen Positionen der Bandspitzen zu extrahieren.
Plotten Sie den Datensatz mit der Funktion plot, um die optische Dichte als Funktion der Wellenlänge zu visualisieren. Identifizieren und markieren Sie die anfänglichen Peakwellenlängen, Lambda eins und Lambda zwei, indem Sie ihre ungefähren Positionen in den dargestellten Daten auswählen. Passen Sie die Daten mit der Peak-Fit-Funktion des Ursprungsprogramms an.
Rufen Sie das Diagramm ab, in dem die zentralen Peakpositionen für jedes Lambda mit der Bezeichnung XCI zusammen mit den entsprechenden Bandbereichen, die als AI bezeichnet werden, angezeigt werden. Exportieren Sie die extrahierten Peakpositionen und die entsprechenden Flächen zur Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Berechnen Sie den Gewichtungsfaktor AI für jedes Peakzentrum, indem Sie die Fläche des Bandes mit der Gesamtfläche der gesamten Bänder vergleichen, indem Sie die angezeigte Formel verwenden. Extrahieren Sie dann die durchschnittliche Peakposition mithilfe der auf dem Bildschirm angezeigten Gleichung.
Um ein Reversibilitätsdiagramm zu erstellen, tabellarisch die durchschnittlichen Peakpositionen in Abhängigkeit von der Operationsnummer N darstellen.Weisen Sie die Operationsnummer N zu, wie auf dem Bildschirm angegeben. Analysieren Sie die Peakposition bei N anhand der angezeigten Formel. Übertragen Sie den berechneten Datensatz in die Ursprungssoftware und plotten Sie ihn.
Wählen Sie Nichtlineare Kurvenanpassung der Analyse aus, geben Sie die Anfangswerte für A, B, C, D und E ein, und klicken Sie auf Ausführen, um die Kurvenanpassung abzuschließen. Um eine Raman-Bildgebung durchzuführen, werden für jede Probe mit der Operationsnummer N 100 Mikroliter Lösung auf eine Glimmerscheibe mit einem Durchmesser von einem Zentimeter gegeben. Lassen Sie die Proben vor der Messung über Nacht trocknen.
Sammeln Sie als Nächstes Weißlichtbilder für jede Vorgangsnummer N.Bereiten Sie die separate Probe auf einer neuen Glimmerscheibe vor, da der pH-Wert kontinuierlich zwischen vier und 10 geändert wird. Erfassen Sie das Raman-Bild für jede Operationsnummer und verwenden Sie die genannten Spezifikationen eines Lasers mit einer Wellenlänge von 633 Nanometern. Nehmen Sie Bilder in einem Raster von 100 x 100 Pixeln mit einer bestimmten Integrationszeit auf, wobei Sie sich auf den gewünschten Spektralbereich konzentrieren.
Plotten Sie das repräsentative Spektrum für jede Operationsnummer N, ausgerichtet als Funktion von N.Konstruieren Sie eine dreidimensionale oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS-Spektrum) als Funktion von N für A beta 1-40-beschichtetes 20-Nanometer-Gold. Verwenden Sie die Draufsicht des Spektrums als Konturkarte, um die spezifischen Moden zu extrahieren, die mit einer bestimmten pH-Bedingung verbunden sind. Identifizieren Sie spektrale Merkmale, die ausschließlich bei geraden oder ungeraden Operationszahlen verbessert werden.
Die SPR-Bande von A-Beta-1-40-beschichteten Goldnanopartikeln verschob sich von 530 Nanometern auf etwa 650 Nanometer, als die Lösung saurer gemacht wurde. Dies entsprach der Bildung von Goldkolloidaggregaten mit ungefalteten A beta 1-40-Monomeren, wie sie bei TEM beobachtet wurde. Die pH-abhängige Farbänderung von A beta 1-40-beschichtetem Gold war ebenfalls offensichtlich.
Die reversible pH-abhängige Verschiebung der durchschnittlichen Bande erreichte ihren Höhepunkt zwischen einer kürzeren und einer längeren Wellenlänge, und die in der TEM beobachtete alternative dispergierte und aggregierte Morphologie bestätigte die quasi-reversible Natur des Prozesses. Die Weißlichtbildgebung zeigte ein klares, reversibles Aggregationsmuster, das den pH-Verschiebungen entsprach, während die SERS-Spektren subtile pH-abhängige Veränderungen im Fingerabdruckbereich zeigten.
