Diese Arbeit wird unterstützt durch ein Stipendium für s.h.-A. von NIH/NCATS (TL1TR001104) ein Welch Foundation grant (I-1827) und einem R01 Stipendium NIGMS (RGM120502A), Z.W. Z.W. ist der Virginia Murchison Linthicum Gelehrte in medizinische Forschung und Prävention von Krebs und Research Institute of Texas Scholar (R1222).

1. Proben vorbereiten
<ol><li>Kultur 2 x 106 Amyloid Herstellung von HT-29 Darmkrebszellen in einer Gewebekultur 10 cm Schale in 10 mL von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum und Penicillin-Streptomycin. Zellkulturen über Nacht in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2.<ol>
<li>Nachdem die Zellen zu 80 % Konfluenz wachsen, Waschen der Zellen mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). 3 mL Trypsin-Lösung hinzugeben und bei 37 ° C für 3 min inkubieren.</li>
		<li>Nachdem die Zellen aus der Schale vollständig dissoziiert sind, fügen Sie 10 mL Kulturmedium und übertragen Sie die Zellen mit einer 10 mL-Pipette auf eine 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie das Medium, Aufschwemmen der Zellen in 5 mL Kulturmedium und zählen Sie die Zellen, die Zelle Zähler. Platte 2 x 106 Zellen in jedem der zwei 10-cm-Gerichte.</li>
		<li>Lassen Sie die Zellen haften und über Nacht in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2zu erholen. Wenden Sie Behandlung auf ein Gericht induzieren die Bildung von amyloiden mit 20 ng/mL Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF-α), 100 nM Smac-mimetischen und 20 µM Pan-Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK11 an. Die Kombination wird als ASZ abgekürzt. Die andere Schale mit Fahrzeug als ein Steuerelement zu behandeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach der entsprechenden Länge der Zeit in der Regel 6 h Ernte der Zelle lysate.<ol>
<li>Kratzen Sie die Zellen aus der Platte mit einem Plastikschaber und verwenden Sie eine 10-mL-Pipette in ein 15 mL konische Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 3 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen 2 mal von resuspending in 10 mL Eis kaltem PBS und Zentrifugieren bei 1.000 x g für 3 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die PBS-Lösung. Hinweis: Der Prozess kann hier durch Einfrieren der Zelle Pellet in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei ˗80 ° C für bis zu 1 Monat angehalten werden.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zelle Pellet zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und inkubieren Sie in 0,3 mL Lyse-Puffer für 30 min auf Eis. Zentrifuge bei 20.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Der Überstand ist die ganze Zelle lysate. Hinweis: Der Prozess kann hier durch die Speicherung der Probe bei-20 ° C bis zu mehreren Monaten angehalten werden.</li>
		<li>Messen Sie die Proteinkonzentration von Bradford-Test laut Protokoll des Herstellers. Fügen Sie 4 x SDD-Alter laden Puffer 20 µL 3 µg/µL Probe vorbereiten und in 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bereiten Sie vor und führen Sie Gele aus
<ol><li>Fügen Sie 2 g Agarose, 200 mL 1 X Tris-Acetat-Puffer (TAE) in ein Becherglas und Hitze in der Mikrowelle zu schmelzen die Agarose. Fügen Sie 1 mL 20 % SDS für eine Endkonzentration von 0,1 % SDS. Schwenken Sie vorsichtig mischen. Achten Sie darauf, keine um Luftblasen nach der SDS-Zugabe zu generieren.</li>
	<li>Gießen Sie die Agarose-Lösung in eine Gel-Platte 15 x 14 cm. Verwenden Sie eine 1-mL-Pipette, um eventuell Luftblasen zu beseitigen. Legen Sie eine 20-Well-Kamm an der Spitze.</li>
	<li>Erste dimension: Pipette 60 µg ganze Zelle lysate auf der rechten Spur. Führen Sie das Gel bei 60 V für ca. 4 h (bis Farbstoff vorne ca. ¾ durch das Gel ist) mit der TAE mit 0,1 % SDS als der laufenden Puffer.</li>
	<li>Zweite dimension: Drehen Sie vorsichtig das Gel 90° gegen den Uhrzeigersinn (Abb. 2A). Führen Sie das Gel bei 60 V für ca. 4 h. Hinweis: Die laufenden Allgemeinzustand ist 4 V/cm Gel Länge. Es ist wichtig, dass die Betriebsbedingungen für die erste und zweite Abmessungen identisch sind.</li>
</ol>(3) Übertragung
<ol><li>Verwenden Sie die Kapillare Übertragungsmethode, um die Proteine auf einer Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran (Abbildung 2B) zu übertragen.<ol>
<li>Geben Sie 500 mL Übertragung Puffers, ein ca. 20 cm x 20 cm Container. Machen Sie einen 5 cm hohen Stapel Papier Handtücher neben dem Container. Die Fläche von oben auf den Stapel muss größer als die Gel-Dimensionen sein.</li>
		<li>Transfer-Puffer ein 14 cm x 15 cm-Filterpapier einziehen und oben auf dem Stapel Papier Handtuch legen. Achten Sie darauf, um auf dem Papier keine Falten oder Bläschen zu platzieren. Wiederholen Sie mit einem anderen Stück Filterpapier.</li>
		<li>Aktivieren eine 14 x 15 cm-PVDF-Membran in Methanol für 30 s Schicht es dann auf dem Filterpapier kümmert sich um eine Walze zu verwenden, um alle Luftblasen zu entfernen. Spülen Sie das Gel mit Transfer-Puffer und Schicht es oben auf der Membran, die Bläschen wieder Ausrollen.</li>
		<li>Decken Sie den Rand des am nächsten an den Container des Transfer-Puffer mit Plastikfolie Papierhandtücher. Es ist wichtig, dass die papierene Brücke gebaut im nächsten Schritt nicht in direkten Kontakt mit dem Papier-Handtuch-Stack kommt.</li>
		<li>Genießen Sie ein Stück Filterpapier 15 x 35 cm in Transfer-Puffer und legen Sie sie so einseitig die Oberseite des Gels bedeckt und das andere Ende im Container des Transfer-Puffer ist. Wiederholen Sie dies mit einer weiteren Brücke.</li>
		<li>Decken Sie den Container mit Plastikfolie und lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Western Blot-Erkennung
<ol><li>Spülen Sie die Membran mit 50 mL PBS mit 0,05 % Tween-20 (PBST) in einem Container 20 × 20 cm. 20 mL 5 % Milch in PBST hinzugeben. Felsen bei Raumtemperatur für 30 min zu blockieren.</li>
	<li>Pipette 10 µL Kaninchen-Anti-MLKL-Antikörper in 20 mL 5 % Milch in PBST und füllen in den Behälter. Wippe über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie die Membran für 5 min. Wiederholen Sie 5 Mal in 20 mL PBST.</li>
	<li>Pipette 4 µL anti-rabbit-HRP 20 ml 5 % Milch in PBST und füllen in den Behälter. Wippe in 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran für 5 min. Wiederholen Sie 5 Mal in 20 mL PBST.</li>
	<li>Verstärkte Chemilumineszenz Substrat (ECL) hinzufügen und Röntgenfilme laut Protokoll des Herstellers setzen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response.">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIP1/RIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis.">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis.">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li><li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+as+protein-based+genetic+elements.">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+2014:+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis.">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li><li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level.">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase.">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Der wichtigste Aspekt des 2D SDD-Zeitalters ist, dass die Elektrophorese-Bedingungen für die erste und zweite Dimension gleich sind. Die Fähigkeit zu erkennen, eine scharfe diagonale Linie auf 45° (d. h., die keine Dissoziation oder Verschlechterung eingetreten ist) hängt von der Fasern, die Migration in identischer Weise sowohl bei electrophoreses. Mit unterschiedlichen Bedingungen, zum Beispiel indem die Spannung oder die Länge der Laufzeit, werden diese Ergebnisse verdecken. Auch, wie bei traditionellen 1D der Fa...

Die Bildung von Amyloid Fasern durch Protein misfolding ist seit langem bekannt in pathologischen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Huntington-Krankheit1eine Rolle spielen. In jüngerer Zeit, die Bildung von Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern nachweislich die Signalwege bei Menschen, auch während der Anti-virale angeborene Immune Antwort2 und Necroptosis3,4, und bei niederen Organismen gehören z. B. Hefe5,6. Daher ist die Fähigkeit, diese Fasern im Labor erkennen wichtig. Derzeit gibt es drei Arten Amyloid und Amyloid-wie Fasern zu erkennen: die Verwendung von Farbstoffen, EM und SDD-Alter.
Die Verwendung von Farbstoffen, z. B. Kongo-rot oder Thioflavin T, bietet den Vorteil, schnell und leicht nachweisbar mit Mikroskopie oder Spektroskopie7. Erkennung von Mikroskopie, im Falle von Kongo-rot, bietet jedoch keine Besonderheit, welche Proteine die Fasern oder die Größe der Fasern bestehen. Ebenso bietet die Verwendung der Spektroskopie, Kongo-rot oder Thioflavin T Bindung an Proteinkomplexe erkennen nur ein positives oder negatives Ergebnis.
EM bietet schlüssige Beweise für die Anwesenheit von Fasern und auch quantitative Informationen über die Faser Länge und Durchmesser8. Diese Methode erfordert jedoch sehr strenge Reinigung. Darüber hinaus ist EM eine spezielle Technik, die teure Ausrüstung verwendet.
SDD-AGE wurde zur SDS-resistente Mega Dalton Proteinkomplexe einschließlich amyloide oder Amyloid-wie Fasern zu erkennen. Es bietet viele Vorteile. Erstens, es erfordert nicht die Reinigung der Fasern und ist leicht zu Peform9. Zweitens bietet es qualitative Informationen über die Größe der Fasern, einschließlich der relativen Größe und Menge der Faser Heterogenicity. Schließlich, weil westliche Beflecken nach Elektrophorese durchgeführt werden kann, ist es einfach, das Vorhandensein von jedem, das Protein für die ist ein Antikörper erkennen, obwohl anzumerken ist, dass da SDD-Alter Semi-denaturierenden ist, einige Epitope verdeckt die verbleiben können Erkennung erschwert von Antikörpern.
Vor kurzem, Rezeptor Interaktion Proteinkinase 1 (RIPK1) und 3 (RIPK3) gemeldet wurden, Form Amyloid Fasern dienen als Signalisierung Plattformen während der Necroptosis, eine programmierte Form der Nekrose3. Während des Studiums diese Fasern, zeigte unserem Labor, dass ein anderes Necroptosis-assoziierten Protein, gemischte Abstammung Kinase-Domäne-wie (MLKL), auch Amyloid-wie Fasern4gebildet. Allerdings erschien bei Betrachtung mit dem SDD-Alter, die Größe der MLKL Fasern unterscheidet sich von der RIPK1 und RIPK3 Fasern, die identisch zueinander (Abbildung 1) erschienen. Das war unerwartet, da es bekannt ist, dass MLKL an RIPK1/RIPK3 bindet bilden die Necroptosis Signalisierung Komplex namens Necrosome10.
Es gibt mindestens zwei Erklärungen. Zunächst zwei völlig unterschiedliche Amyloid-wie Fasern können während der Necroptosis, ein mit RIPK1/RIPK3 und die andere mit MLKL bilden. Zweitens ist nur eine Art von Amyloid-wie Fasern, die mit RIPK1/RIPK3/MLKL bei Necroptosis, sondern die Vereinigung des MLKL mit anderen Proteinen entstehen kann schwach genug, die es während der SDD-Alter distanziert.
Um dieses Problem anzugehen, schlagen wir eine zweidimensionale (2D) SDD-Alter durchführen. SDD-Alter-Stable Amyloid oder Amyloid-wie Fasern haben das gleiche Migration Muster während der ersten und zweiten Dimension Elektrophorese. Dies wird nach der Proteine auf eine Membran übertragen und ein Western-Blot nachweisbar sein. Stabilere Fasern zeigen eine scharfe Muster mit diagonalen Streifen. Jede Abweichung von diesem würde vorschlagen, dass die Fasern durch die SDS-Elektrophorese verändern.

<table><tbody><tr><td>gel electrophoresis unit</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>appratus for gel running.</td></tr><tr><td>agrose</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>For agarose gel.</td></tr><tr><td>paper tower</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>filter paper</td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>blocking milk powder</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>for blocking in Western blot</td></tr><tr><td>MLKL antibody</td><td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>rabbit anti-MLKL antibody</td></tr><tr><td>RIPK1 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>mouse anti-RIPK1 antibody</td></tr><tr><td>RIPK3 antibody</td><td>gift from Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>secondary antibody</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Fisher</td><td>WBKLS0500</td><td>Western chemiluminescent HRP substrate</td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Fisher</td><td>F-BX810</td><td>for Western blot result</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>penicilin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin solution</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>PBS for tissue culture</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>recombinant TNF</td><td>made in our lab</td><td></td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>smac-mimetic</td><td>gift from Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Model TC20; for counting cells</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>for measuring protein concentration in cell lysates</td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Fisher</td><td>07-200-364</td><td>to remove cells from dish</td></tr><tr><td>Lysis Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4&lt;br/&gt; 10 mL glycerol&lt;br/&gt; 30 mL 5 M NaCl&lt;br/&gt; 840 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 10 mL Triton-X100&lt;br/&gt; (protease and phosphates inhibitors as desired)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td><td>48.4 g Tris base&lt;br/&gt; 11.42 mL glacial acetic acid&lt;br/&gt; 20 mL 0.5M EDTA pH 8&lt;br/&gt; ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 to 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)</td><td></td><td></td><td>5 mL 10X TAE&lt;br/&gt; 10 mL glycerol&lt;br/&gt; 4 mL 20% SDS&lt;br/&gt; 0.5 mL 10% bromophenol blue&lt;br/&gt; 31 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>TBS Transfer Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4&lt;br/&gt; 30 mL 5 M NaCl&lt;br/&gt; 950 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PBST Wash Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS&lt;br/&gt; 800 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl&lt;br/&gt; 20 g KCl&lt;br/&gt; 144 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; add ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 10 L</td></tr></tbody></table>

use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers

Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern wurden mit vielen menschlichen Krankheiten und sind jetzt wichtig für viele Signalwege entdeckt. Die Fähigkeit, die Bildung dieser Fasern unter verschiedenen experimentellen Bedingungen leicht zu erkennen ist wichtig für das Verständnis ihrer potenzialfunktion. Viele Methoden wurden verwendet, um die Fasern zu erkennen, aber nicht ohne einige Nachteile. Elektronenmikroskopie (EM) oder Färbung mit Kongo-rot oder Thioflavin T oft erfordert z. B. Reinigung der Fasern. Auf der anderen Seite ermöglicht Waschmittel Semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese (SDD-Alter) Erkennung der SDS-resistente Amyloid-ähnliche Fasern in zellextrakte ohne Reinigung. Darüber hinaus ermöglicht es den Vergleich der Größenunterschied der Fasern. Noch wichtiger ist, kann verwendet werden, um bestimmte Proteine innerhalb der Fasern durch westliche Beflecken zu identifizieren. Es ist weniger zeitaufwändig und leichter zugänglich, eine größere Zahl von Labs. SDD-Alter Ergebnisse zeigen oft Variablen Grad der Heterogenität. Es stellt sich die Frage ob die Dissoziation der Proteinkomplex während der Elektrophorese in Anwesenheit von SDS Bestandteil der Heterogenität entsteht. Aus diesem Grund haben wir eine zweite Dimension der SDD-alt sein, um festzustellen, ob die Größe Heterogenität in SDD-Alter gesehen wirklich ein Ergebnis der Faser Heterogenität in Vivo und kein Ergebnis einer Verschlechterung oder Dissoziation von einige der Proteine während beschäftigt Elektrophorese. Diese Methode ermöglicht schnelle und qualitative Bestätigung, das Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern nicht teilweise während des Prozesses der SDD-Alter entkoppelt sind.

Nach Necroptosis Induktion zeigten RIPK1 und RIPK3 fast identische Amyloid-Mustern (Bahnen 2 und 4, Abbildung 1). Jedoch MLKL Fasern wurden heterogener und schien kleiner als RIPK1/RIPK3 Fasern (Bahn 6, Abbildung 1). Das veranlasste uns, die 2D SDD-Alter-Methode, um die Möglichkeit zu befassen, ob MLKL RIPK1/RIPK3-unabhängige Fasern bildet oder MLKL einfach distanziert sich von den großen RIPK1/RIPK3/MLKL-Fasern während SDD-A...

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Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen

Hier verwenden wir zweidimensionale Semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese bestätigen das Vorhandensein von Amyloid-wie Fasern von heterogenen Größe und die Möglichkeit, die die Größe Heterogenität durch Dissoziation der Amyloid Fasern während des Gels ist ausgeschlossen laufenden Prozess.

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

use-two-dimensional-semi-denaturing-detergent-agarose-gel

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K Aufrufe.  UT Southwestern Medical Center. Hier verwenden wir zweidimensionale Semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese bestätigen das Vorhandensein von Amyloid-wie Fasern von heterogenen Größe und die Möglichkeit, die die Größe Heterogenität durch Dissoziation der Amyloid Fasern während des Gels ist ausgeschlossen laufenden Prozess.

Serie: Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's disease pathogenesis1. A&beta; is predominantly a 40- or 42-amino acid peptide that is prone to self-aggregation into &beta;-sheet-rich amyloid fibrils that are found in the cores of cerebral senile plaques in Alzheimer's disease. Increasing evidence suggests that low molecular weight, soluble A&beta; multimers are more toxic than fibrillar A&beta; amyloid2. The identification and quantification of low- and high-molecular weight multimeric A&beta; species in brain tissue is an essential objective in Alzheimer's disease research, and the methods employed also can be applied to the identification and characterization of toxic multimers in other proteopathies3. Naturally occurring A&beta; multimers can be detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with A&beta;-specific antibodies. However, the separation and detection of multimeric A&beta; requires the use of highly concentrated cortical homogenates and antigen retrieval in small pore-size nitrocellulose membranes. Here we describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, separation of proteins by SDS-PAGE, and antigen-epitope retrieval/Western blotting with antibody 6E10 to the N-terminal region of the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect A&beta; monomers, dimers, trimers, tetramers, and higher molecular weight multimers in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

We describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, protein separation by SDS-PAGE, antigen retrieval and immunoblotting with an antibody to the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect monomeric and multimeric A&beta; in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

Forschung

Neurowissenschaften

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Biologie

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

Separating Protein with SDS-PAGE: Procedure and Applications

Proteinauftrennung mittels SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

Lehre

JoVE Science Education

Grundlegende Biologie

Grundlegende Methoden in der Zell und Molekularbiologie

Two-Dimensional Gel Electrophoresis

Two-dimensional gel electrophoresis (2DGE) is a technique that can resolve thousands of biomolecules from a mixture. This technique involves two distinct separation methods that have been coupled together: isoelectric focusing (IEF) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). This physically separates compounds across two axes of a gel by their isoelectric points (an electrochemical property) and their molecular weights.
The procedure in this video covers the main concepts of 2DGE and a general procedure for characterizing the composition of a complex protein solution. Three examples of this technique are shown in the applications section, including biomarker detection for disease initiation and progress, monitoring treatment in patients, and the study of proteins following posttranslational modification (PTM).
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Two-dimensional, or 2D, gel electrophoresis is a technique utilizing two distinct separation methods which can separate thousands of proteins from a single mixture. One of the techniques, SDS-PAGE or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, cannot fully separate complex mixtures alone. 2D gel electrophoresis couples the SDS-PAGE to a second method, isoelectric focusing or IEF, which separates based on isoelectric points, allowing for the resolution of potentially all proteins in a cell lysate. This video will show the principles of 2D gel electrophoresis, a general procedure, and some of its biomedical applications.
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2D gel electrophoresis begins with IEF as the first dimension. Every protein has a pH value, called the isoelectric point or pI, where the net charge is zero. When a protein is subjected to an electric field, it will move toward the electrode with opposite charge. Samples of interest are loaded onto immobilized pH gradient, or IPG, strips which have embedded ampholytes, molecules containing both acidic and basic groups. An electric field is then applied to the pH gradient strip, causing the proteins to migrate until they reach the pH value matching their pI, where they lose their net charge.
Prior to running the second-dimension, the embedded proteins are treated with SDS, denaturing them and providing a uniform negative charge. Once completed, the IPG strips are placed onto a polyacrylamide gel. An applied electric field draws the proteins toward the anode, with larger proteins moving more slowly through the gel.
Once the protein mixture has been separated according to pI and molecular weight, the proteome map is visualized using stains, and proteins of interest are identified.
Now that we have discussed the principles of 2D gel electrophoresis, let&#39;s go over a typical laboratory procedure.
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Before the experiment can be performed, the proteins must be solubilized into media. Solubilization of the sample is achieved by de-aggregating proteins with a combination of chaotropic agents for disrupting hydrogen-bonding interactions, nonionic detergents to prevent altering of the proteins&#39; charge, reducing agents to break disulfide bonds, and buffers. To remove interfering abundant proteins and other molecules, the material is sequentially extracted by centrifugation, and collection of the resulting pellet; followed by treatment with endonuclease, an enzyme used to consume any DNA that would interfere with the experiment.
Once the proteins have been solubilized, IPG strips are prepared by rinsing with a strip-cleaning solution and left upside-down to dry. Each strip is then assigned a strip holder number. Once ready, the cellular extract is loaded onto the strips in a slow, sliding motion from the negative to the positive end. For the purpose of rehydration, damp blotting paper is placed on top of the electrode and under the gel strips; the IPG strips are then lined onto the IEF instrument. A high electric current is applied, and the proteins begin to migrate.
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Following completion of the first dimension, the gel for SDS-PAGE is prepared in a casting apparatus. The IPG strips are treated by placing them face down in SDS-containing equilibration buffer. The electrophoresis unit is readied with the addition of electrophoresis buffer. The treated IPG strips are collected using tweezers, placed on top of the gel plates, and sealed with agarose-sealing solution. A voltage source then applies an electric field, which is held until the fastest-moving proteins are 1 cm from the bottom of the gel.
After completion of the electrophoresis, the proteins must be visualized. Traditionally this is performed by staining with Coomassie blue or silver nitrate. Proteins of interest may be transferred from the gel, and analyzed by Western blot analysis.
A second identification approach involves excision of the proteins from the gel, digesting them, than analyzing them by mass spectrometry.
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Now that we&#39;ve reviewed a procedure, let&#39;s look at some of the uses for 2D gel electrophoresis.
One of the most common uses for this technique is the identification of molecules involved in disease initiation and progression. 2D gel electrophoresis, coupled with mass spectrometry, can detect the up- or down-regulation of specific proteins in diseased areas in comparison to healthy ones.
Additionally, 2D gel electrophoresis is useful in following the progress of patients&#39; response to a potential therapeutic drug. Specimens may be taken from patients at various timepoints following administration of the treatment. In this way, 2D gel electrophoresis coupled with Western blot or mass spectrometry analysis, can detect proteins associated with negative responses such as inflammation; or the absence of proteins in an alleviated state.
Another use for 2D gel electrophoresis is in the study of protein structure and function following posttranslational modification, or PTM, which are additions to proteins following their translation from mRNA. PTM&#39;s can regulate a variety of functions, including protein signaling, gene expression, or cause oxidative damage. 2D gel electrophoresis is sensitive to modifications such as methylation or acetylation, which can cause a shift in pI as well as the molecular weight.
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You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on 2D gel electrophoresis. This video described the principles of the technique, a typical experimental procedure, and several of its applications in the field of biomedicine.
Thanks for watching!
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Zweidimensionale Gelelektrophorese

Two-dimensional gel electrophoresis (2DGE) is a technique that can resolve thousands of biomolecules from a mixture. This technique involves two distinct ...

Chemie

Grundlagen der Biochemie

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

Source: Upadhyay, A. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63816">Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the protocol for isolating&#160; amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

Isolierung von Amyloid-Fibrillen aus Hirngewebeextrakt

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Tissue harvesting and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

Two-Dimensional Semi-Denaturing Agarose Gel Electrophoresis: A Technique to Separate Polymorphic Amyloids Fibers Based on Size Heterogeneity

Source: Hanna-Addams, S., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57498">Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the two-dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis-based separation of amyloid fibers. The technique separates the polymorphic amyloid aggregates based on their heterogeneous size.

Zweidimensionale semi-denaturierende Agarose-Gelelektrophorese: Eine Technik zur Trennung polymorpher Amyloidfasern basierend auf Größenheterogenität

Source: Hanna-Addams, S., et al. Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or ...

Biological Techniques

Electrophoresis Techniques

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Source: Zhan, X., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56739">Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese: eine Trenntechnik zur Analyse von Proteinen in komplexen Proteingemischen basierend auf Ladung und Molekulargewicht

Source: Zhan, X., et al. Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis

Two-dimensional gel electrophoresis is a high-resolution protein separation method first introduced by O&#39;&#160;Farrell and Klose in 1975. This method involves protein separation by two dimensions, mass and charge, making it more accurate than one-dimensional gel electrophoresis.
The first dimension separation uses the isoelectric focusing or IEF technique performed on immobilized pH gradient (IPG) strips that separate proteins according to their isoelectric points.
Biological samples, such as&#160; cells and tissues, are first prepared for IEF by treatment with a buffer containing urea, dithiothreitol, detergents, and ampholytes. Here, urea and detergent solubilize and denature the proteins. Dithiothreitol is a reducing agent that cleaves disulfide bonds. Ampholytes used in a suitable concentration solubilize the protein and maintain pH. The buffer also rehydrates the IPG strip that helps it absorb the proteins before their charge-based separation.
Proteins are amphoteric molecules with positive and negative charges. The amphoteric protein molecules migrate on the pH gradient of the IPG strip under the electric current. Once the proteins reach their isoelectric point, they immobilize because, at this point, they have no net charge. IPG strips have a fixed pH gradient; for instance, strips with a smaller pH range (for example, pH 4-7) can detect proteins with higher accuracy than those with a broader range (pH 3-10). Once the proteins separate, the IPG strips are treated with sodium dodecyl sulfate (SDS) buffer to proceed to the next phase, i.e., mass-based separation using SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis). SDS covers the uncharged protein on the IPG strips with a negative charge, and glycerol reduces electroendosmosis which helps the transfer of proteins from the first to the second dimension.
Generally, bands on the gel can be visualized upon staining. Sometimes radiolabelled samples are used to obtain an autoradiographic image. Samples capable of producing fluorescent images can also be used.
Two-dimensional gel electrophoresis has gained importance owing to the precision of the outcome results. However, the method is unsuitable for distinguishing highly hydrophobic proteins,&#160; proteins with high molecular mass, or those present in very low quantities per cell.

Two-dimensional gel electrophoresis is a high-resolution protein separation method first introduced by O&#39;&#160;Farrell and Klose in 1975. This method ...

Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval

Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Proteinauftrennung mittels SDS-PAGE

Zweidimensionale Gelelektrophorese

Isolierung von Amyloid-Fibrillen aus Hirngewebeextrakt

Zweidimensionale semi-denaturierende Agarose-Gelelektrophorese: Eine Technik zur Trennung polymorpher Amyloidfasern basierend auf Größenheterogenität

Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese: eine Trenntechnik zur Analyse von Proteinen in komplexen Proteingemischen basierend auf Ladung und Molekulargewicht

Zweidimensionale Gelelektrophorese