Extrazelluläre Matrix oder numerische ECM-Hydrogel-Mikropartikel können als Bausteine für die Gerüstherstellung verwendet werden. Dieses Protokoll demonstriert die Herstellung, Reinigung, Gefriertrocknung, Fotomontage und 3D-Bioprinting von Gelatine-Methacryloyl- oder GelMA-Hydrogel-Mikropartikeln. GelMA ist ein photochemisch vernetzbares, proteinbasiertes Biopolymer, das Zellklebstoff und biologisch abbaubare Einheiten enthält und als zellresponsives und lehrreiches Biomaterial weit verbreitet ist.
Im Vergleich zu herkömmlichem Bulk-Hydrogel sind GelMA-Hydrogel-Gerüste mikroporös und ermöglichen eine schnelle Zellinfiltration, die an die Bausteingröße angepasst werden kann. GelMA granulare Hydrogel-Gerüste können neue Möglichkeiten für das 3D-Bioprinting von dicken Geweben, Organen und Krankheiten auf billigen Plattformen und regenerativem Engineering eröffnen. Fügen Sie zunächst 10 Milligramm LAP zu 10 Millilitern DPBS hinzu, um eine 0,1%ige Photoinitiatorlösung herzustellen.
Schützen Sie die Lösung vor Licht, indem Sie sie mit Aluminiumfolie umwickeln und beschriften. Als nächstes wird die gewünschte Menge GelMA in der Photoinitiatorlösung gelöst. Legen Sie die in Aluminiumfolie eingewickelte Lösung für eine Stunde in den 37-Grad-Celsius-Ofen, um eine klare Lösung zu erhalten.
Um die Ölphase vorzubereiten, stellen Sie eine 2%ige biokompatible Tensidlösung in der technischen Flüssigkeit her. Führen Sie den Tygon-Schlauch in die Ein- und Auslässe des PDMS-Geräts ein und führen Sie dann eine 25-Gauge-Stumpfnadel in das andere Ende des Tygon-Schlauchs für die Einlässe ein. Stellen Sie das Gerät unter das Mikroskop und halten Sie die Umgebung mit einem Haartrockner oder einer Raumheizung bei ca. 40 Grad Celsius warm.
Laden Sie die wässrigen und öligen Lösungen in separate Spritzen, die an das Gerät angeschlossen sind. Starten Sie die Spritzenpumpe für die Ölphase mit einer Durchflussrate von 160 Mikrolitern pro Minute. Nachdem Öl den Kanal gefüllt hat, beginnen Sie die wässrige Phase mit 80 Mikrolitern pro Minute.
Überprüfen Sie die Tröpfchenbildung unter dem Mikroskop. Sammeln Sie die Tröpfchen in einem Behälter und werten Sie sie in der Bildgebungskammer durch optische Mikroskopie aus. Halten Sie die Tröpfchen über Nacht bei vier Grad Celsius und schützen Sie sie gleichzeitig vor Licht, um die physikalische Vernetzung des GelMA-Mikrogels zu initiieren und die Tröpfchen in stabile Mikrogele umzuwandeln.
Um die mikrotechnische Emulsion-zu-Pulver-Methode (MEtoP) zu implementieren, sammeln Sie die physikalisch vernetzten Mikrogele in der technischen Flüssigkeit unter Verwendung von thermisch haltbaren Mikrozentrifugenröhrchen oder Kryozellen. Verschließen Sie das offene Röhrchen mit einem Labortuch und Klebeband. Die physikalisch vernetzten Mikrogele werden 10 Minuten lang in flüssigem Stickstoff tiefgefroren, um mit der Gefriertrocknung fortzufahren.
Nach der Gefriertrocknung wird ein festes Pulver erhalten. Fügen Sie dem lyophilisierten Pulver einen Milliliter gekühlte, 0,1%ige Photoinitiatorlösung bei vier Grad Celsius hinzu, um Mikrogelsuspensionen herzustellen. Zentrifugieren Sie die gewirbelte Mischung bei 3.000 g für 15 Sekunden.
Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, übertragen Sie die verpackte Mikrogelsuspension mit einer Verdrängungspipette in eine Form und setzen Sie sie 60 Sekunden lang Licht mit einer Wellenlänge von 400 Nanometern mit einer Intensität von 15 Milliwatt pro Quadratzentimeter aus, um körnige Hydrogelgerüste oder GHS zu bilden. Für 400 Mikroliter Mikrogelsuspension wird eine gleiche Menge eiskalter PFO-Lösung, 20 % in technischer Flüssigkeit, zu den physikalisch vernetzten GelMA-Mikrogelen gegeben. Zentrifugieren Sie dann die gewirbelte Mischung bei 300 g für 15 Sekunden und entfernen Sie die Ölphase durch Pipettieren aus den GelMA-Mikrogelen.
Geben Sie dann 400 Mikroliter eiskalte, 0,1%ige Photoinitiatorlösung in die Mikrogelsuspension. Nachdem Sie die Wirbellösung 15 Sekunden lang bei 300 g zentrifugiert haben, entsorgen Sie das Öl. Wiederholen Sie die Schritte der Zugabe und Zentrifugation der Photoinitiatorlösung, aber zentrifugieren Sie diesmal bei 3.000 g und entsorgen Sie den Überstand der verpackten GelMA-Mikrogele.
Übertragen Sie die verpackten GelMA-Mikrogele in eine Form und belichten Sie sie anschließend, um das GHS zu bilden. Fügen Sie 100 Milligramm Nanoplättchenpulver zu drei Millilitern eiskaltem, hochreinem Wasser hinzu, um eine 3,33%ige Nanopartikeldispersion zu bilden. Wirbeln Sie die Dispersion 15 Minuten lang kräftig in einem Kühlschrank mit vier Grad Celsius, um die aggregierten Nanopartikel zu entfernen.
Richtig gepeelte Nanopartikel ergeben eine klare Dispersion. Lösen Sie 50 Milligramm LAP in fünf Millilitern eiskaltem, hochreinem Wasser auf, um eine 1%ige Photoinitiator-Stammlösung herzustellen. Geben Sie dann 333 Mikroliter 1%ige Photoinitiatorlösung in die abgeblätterte Nanopartikeldispersion und wickeln Sie sie zum Schutz vor Umgebungslicht in Aluminiumfolie ein.
Wirbeln Sie die Mischung eine Minute lang, um die Nanopartikeldispersion und den Photoinitiator zu mischen. Fügen Sie den physikalisch vernetzten GelMA-Mikrogelen eiskaltes PFO, 20 % in technischer Flüssigkeit, in einem Volumenverhältnis von eins zu eins hinzu. Nachdem Sie das gewirbelte Gemisch 15 Sekunden lang bei 300 g zentrifugiert haben, verwerfen Sie die Ölphase, die das Tensid enthält.
Fügen Sie die eiskalte, LAP-ergänzte Nanopartikel-Dispersion zu den gewaschenen GelMA-Mikrogelen hinzu. Nach dem Zentrifugieren bei 3.000 g für 15 Sekunden das restliche Öl am Boden und die überstehende Dispersion verwerfen. Lagern Sie die Suspension einen Tag lang bei vier Grad Celsius und schützen Sie sie vor Licht mit Aluminiumfolie, um das Produkt GelMA nanoengineered granular bioink oder NGB zu erhalten.
Laden Sie den NGB am nächsten Tag in eine Drei-Milliliter-Spritze. Verschließen Sie die beladene Spritze mit einer Kappe und einem Parafilm und führen Sie eine Impulszentrifugation bei 200 g durch, um die eingeschlossene Luft zu entfernen. Übertragen Sie die Biotinte in eine Drei-Milliliter-Kartusche, indem Sie einen weiblichen Luer-Lock-Anschluss verwenden.
Zentrifugieren Sie die Kartusche erneut kurz bei 200 g, um die eingeschlossene Luft zu entfernen, und halten Sie den NGB vor Gebrauch bei vier Grad Celsius. Als nächstes laden Sie die vorbereitete murine Fibroblastenzellsuspension in eine Drei-Milliliter-Spritze. Koppeln Sie die NGB- und die zellbeladenen Spritzen mit einem weiblich-weiblichen Luer-Lock-Anschluss und mischen Sie den Inhalt vorsichtig, indem Sie ihn 40 Mal hin und her schieben.
Drucken Sie den NGB oder den mit Zellen beladenen NGB mit einem geeigneten Bioprinter mit einer konischen Standarddüse, indem Sie die Düse in den Drei-Milliliter-Druckkopf laden. Halten Sie die Druckbetttemperatur unter 10 Grad Celsius und optimieren Sie Parameter wie Geschwindigkeit und Gegendruck. Wählen Sie die gewünschte gcode- oder STL-Datei aus.
Wählen Sie dann das Substrat und den Düsentyp für eine pneumatische Drei-Milliliter-Spritze aus, die mit einer konischen Standarddüse ausgestattet ist. Kalibrieren Sie den Bioprinter anhand der Geräterichtlinien und beginnen Sie mit dem Drucken, um die 3D-Strukturen zu erhalten. Die MEtoP-Technologie lieferte resuspendierbares getrocknetes Mikrogelpulver durch Niederdruck-Gefriertrocknung und schützte gleichzeitig die Mikrogele vor Aggregation und starker Verformung.
Die REM-Bilder zeigten, dass die getrockneten GelMA-Mikropartikel mit dieser Technologie nach der Lyophilisation ihre sphärische Form behalten, verglichen mit der Aggregation, die bei der konventionellen Lyophilisation beobachtet wurde. Die Mikroporencharakterisierung von GelMA, GHS und NGB mit einem hochmolekularen Fluoreszenzfarbstoff zeigte die miteinander verbundenen mikroskaligen Hohlräume. Auch das Fluoreszenzbild, das mit einem eigens geschriebenen MATLAB-Skript bewertet wurde, erkannte die Poren.
Die Messungen des Hohlraumanteils und des mittleren Porenäquivalentdurchmessers zeigten keinen signifikanten Unterschied, was die Verfügbarkeit und Interkonnektivität von mikroskaligen Poren in den 3D-gedruckten Gerüsten unter Verwendung des NGB bestätigt. Die Überlegenheit von NGB-Gerüsten gegenüber dicht und locker gepackten GelMA-Mikrogelen durch die Messung der hängenden Filamentlänge zeigte, dass NGB eine größere Länge als die gepackten Mikrogele aufwies. Die lose gepackten Mikrogele ergaben keine Filamente.
Ein Hohlzylinder wurde 3D-gedruckt, und das gesamte Konstrukt wurde zur Photovernetzung mit Licht belichtet. Die gedruckte Struktur wurde physisch gehalten, um die Form, Treue und strukturelle Integrität zu zeigen. Wenn das Gerüst für die biologische Bewertung verwendet wird, z. B. beim zellbeladenen Bioprinting, denken Sie daran, alle Schritte unter bestimmten Bedingungen unter der biologischen Sicherheitswerkbank durchzuführen.
Wir hoffen, die Verwendung von granulären Hydrogel-Gerüsten als neu entstandene Biomaterialplattform in der Biomedizin zu vermarkten.
