Diese Technik ermöglicht die Entwicklung eines standardisierten Systems, das einfach aus menschlichen Zelllinien oder primären Zellpopulationen aufgebaut werden kann und Merkmale einer gut organisierten, knochenmarkartigen Struktur bietet. Dieses Modell ermöglicht die Zellernte nach der Fixierung, um die In-situ-Zelllokalisierung innerhalb des Systems durch Bildgebung oder 3D-Strukturdissoziation zu charakterisieren, um jede zelluläre Komponente für molekulare oder funktionelle Studien zu sammeln. Kevin Geistlich, ein Hilfsingenieur aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren.
Wiegen Sie 35 bis 40 Milligramm BCP-Perlen in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen für jeden Einsatz. Das heißt, eine kleine zylindrische Kunststoffschale mit einer Polycarbonatmembran am Boden. Bohren Sie ein kleines Loch mit einer sauberen Nadel durch die Oberseite des 1,5-Milliliter-Röhrchens, um zu vermeiden, dass der Deckel während des Autoklavenzyklus aufspringt, und legen Sie die Röhrchen in vertikaler Position in eine geschlossene, sterile Box.
Legen Sie sterile Polycarbonat-Zellkultureinsätze in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte. Gießen Sie sterile BCP-Perlen aus einem 1,5-Milliliter-Röhrchen in den Einsatz. Waschen Sie die Perlen sorgfältig, indem Sie 350 Mikroliter 1X PBS in den Einsatz tropfen und dann 4,5 Milliliter 1X PBS in den Brunnen geben.
Entsorgen Sie das PBS mit einem Vakuum oder einer Fünf-Milliliter-Pipette, indem Sie die Spitze in eine Ecke des Vertiefungs legen. Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal. Verwenden Sie dann 1X PBS ergänzt mit 10% FBS, um das System zu blockieren.
Geben Sie vorsichtig 350 Mikroliter der Blockierlösung in den Einsatz und 4,5 Milliliter in den Brunnen und legen Sie die gesamte Platte über Nacht in einen Inkubator. Entfernen Sie die blockierende Lösung aus dem System. Mischen Sie 1 mal 10 zu den 6 HMEC-1-Zellen und 2 mal 10 zu den 6 HS27A-Zellen, die die vaskulären bzw. mesenchymalen Stromazellkompartimente darstellen, in einem 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie für fünf Minuten bei 1 575 G bei Raumtemperatur.
Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 175 Mikroliter HMEC-1-Medium hinzu, ergänzt mit 175 Mikrolitern ODM, das die mesenchymale Stromazelldifferenzierung in Osteoblasten fördert. Gießen Sie 350 Mikroliter der Zellsuspension mit 3 mal 10 zu den insgesamt 6 Zellen in jedem Einsatz. Dann gießen Sie 4,5 Milliliter des kombinierten Mediums ohne Zellen in die Vertiefungen der Platte.
Saugen Sie die Mischung vorsichtig ab und dosieren Sie sie mehrmals mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette, um die Zellen und BCP-Perlen im Einsatz zu homogenisieren. Lassen Sie die gesamte Mischung am Boden des Einsatzes absetzen. Sobald die Endothel- und Mesenchymzellen im Inneren des Einsatzes homogenisiert sind, bewahren Sie die Sechs-Well-Platte drei Wochen lang im Inkubator auf.
Wechseln Sie das Medium im Inneren des Einsatzes zweimal pro Woche im Vertiefung, indem Sie das Medium vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette entfernen und die Spitze an der inneren Einlegewand platzieren, um eine Störung der Ecke des Einsatzes zu vermeiden. Resuspendieren Sie die interessierenden hämatologischen Zellen im HMEC-1- und RPMI-Kombinationsmedium und fügen Sie die Zellsuspension zum Einsatz hinzu. Andere interessante Zelltypen mit dedizierten Medien können in diesem Schritt hinzugefügt werden.
Wenn ein medikamentöses Behandlungsprotokoll erforderlich ist, warten Sie 24 Stunden nach dem Hinzufügen der interessierenden Zellen, bevor Sie sie behandeln, damit sie Zeit haben, an der knochenähnlichen Struktur zu haften. Aktualisieren Sie das Medium zweimal pro Woche mit 50 % HMEC-1 vollständigem Medium und 50 % RPMI vollständigem Medium. Nachdem Sie das Kulturmedium zweimal pro Woche gewechselt haben, lagern Sie den gewonnenen Überstand aus dem Inneren des Einsatzes bei minus 80 Grad Celsius, um die Proteinproduktion im System zu bewerten.
Um die Zellen von der 3D-Struktur zu trennen, mischen Sie 4,5 Milliliter RPMI mit 0,5 Milliliter FBS, ergänzt mit 0,4 Milligramm pro Milliliter Kollagenase in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Dann erwärmen Sie die Lösung bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Stellen Sie den Einsatz kopfüber auf eine sterile Abdeckung mit sechs Vertiefungen, um die Membran richtig auszuschneiden.
Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um die Membran von den Seiten zu schneiden und so eine weiße feste Scheibe zu erhalten. Legen Sie die Scheibe in das warme 15-Milliliter-Röhrchen, das die zuvor vorbereitete Lösungsmischung enthält. Legen Sie das Röhrchen in ein aktives Rad in einem 37-Grad-Inkubator und inkubieren Sie für 10 Minuten, um die Verdauung zu ermöglichen.
Wenden Sie für alle Membranen die gleiche Inkubationszeit an, um eine verzerrte Analyse zu vermeiden. Nach der Inkubation das 15-Milliliter-Röhrchen fünf Minuten lang bei 1,575 g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Milliliter warmem 1X PBS.
Resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern warmem Trypsin und mischen Sie es gut durch Pipettieren für 10 Sekunden und legen Sie es für eine Minute in ein Wasserbad, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie einen Milliliter warmes, reines FBS hinzufügen. Mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette saugen und dosieren Sie das Medium, um die Scheibe vollständig zu dissoziieren.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen für fünf Minuten bei 1, 575 G und resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter 1X PBS, ergänzt mit 10% FBS. Lassen Sie die Perlen fünf Sekunden lang sedimentieren, bevor Sie den Überstand sammeln und durch ein 35-Mikron-Zellsieb filtern, das auf einem Sammelrohr platziert ist. Zentrifugieren Sie das gewonnene Filtrat fünf Minuten lang bei 1, 575 G und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau, um die Lebensfähigkeit zu beurteilen.
Resuspendieren Sie die Pellets in der Antikörpermischung und inkubieren Sie für 30 bis 40 Minuten auf Eis vor Licht geschützt. Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu, ergänzt mit 2% FBS, um die Zellen zu waschen und für fünf Minuten bei 1, 575 zu zentrifugieren G.To die Durchflusszytometrie-Analyse zu starten, resuspendieren Sie das gewonnene Pellet in 200 Mikroliter 1X PBS mit 10% FBS, ergänzt mit DAPI in einer 1 bis 2000 Lösung. Analysieren Sie die Röhrchen in einem Zytometer anhand der im Textmanuskript beschriebenen Parameter.
Verwenden Sie ein FSC-H- versus FSC-W-Diagrammdiagramm, um die Singulett-Population zu gate. Verwenden Sie in der Singulettfraktion ein DAPI-A- versus FSC-A-Diagramm, um die lebensfähige Zellpopulation zu bestimmen. Wenn die DAPI-negative Grundgesamtheit zuvor abgegrenzt wurde, verwenden Sie ein APCA-A- versus FSC-A-Diagramm, um die CD45-positive Population zu bestimmen.
Um die BM-ähnliche Struktur zu fixieren, übertragen Sie den Einsatz von der alten Platte auf eine neue Sechs-Well-Platte, die mit 1X PBS gefüllt ist. Ersetzen Sie dann vorsichtig das Medium im Einsatz mit 1X PBS. Sobald der Einsatz gewaschen ist, legen Sie ihn in eine neue Sechs-Well-Platte und füllen Sie sowohl die Vertiefung als auch den Einsatz mit frisch geöffnetem Paraformaldehyd.
Lassen Sie den Fixierungsprozess vier Stunden lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt ablaufen. Als nächstes waschen Sie den Einsatz einmal mit 1X PBS und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius Lichtschutz. Nach der gewünschten Exposition deuteten die Ergebnisse darauf hin, dass es möglich war, hämatologische Zellen für mindestens sechs Wochen innerhalb des 3D-Modells zu erhalten, bevor lebensfähige Zellen gewonnen wurden.
Es war möglich, die HS27A-Zelllinie durch primäres normales Knochenmark-MSC oder akute myeloische Leukämie MSC in diesem 3D-BM-ähnlichen Modell zu ersetzen oder die hämatopoetische Zelllinie durch primäre HSZ zu ersetzen. Paraffin-Embedding und Immunchemie ermöglichten erfolgreich die Analyse von CD45- und CD73-Gehalten anhand der 3D-Modelle. Dieses 3D-System erfordert drei Wochen knochenmarkartige Strukturen und zusätzliche Zeit mit interessanten Zellen.
Und sterile Bedingungen müssen aufrechterhalten werden, da wir manchmal mittlere Verunreinigungen mit den zweimal wöchentlichen Medienwechseln sehen können.
