Wir haben ein Lichtblattmikroskop entwickelt, das die gesamte Cochlea digitalisieren kann. Dieses Mikroskop verfügt über luftmontierte Objektive mit einem großen Arbeitsabstand, die kleine Maus-Cochleas bis zu einem großen menschlichen Schläfenbein abbilden können. Es schneidet die Cochlea seriell mit einem Laserstrahl, ohne eine mechanische Zerstörung zu verursachen.
Mit unserem bildgebenden Verfahren können krankhafte Veränderungen der Cochlea beurteilt werden, wie z.B. der altersbedingte Verlust von Haarzellen und spiralförmigen Ganglienneuronen. Nachdem Sie eine Maus eingeschläfert und enthauptet haben, machen Sie einen dorsal-ventralen Schnitt durch das Gehirn, um den Schädel zu halbisieren. Entfernen Sie das Gehirn und identifizieren Sie die runde Bulla im basoventralen Teil des Schädels.
Öffne die Bulle mit Rongeurs. Dann visualisieren und entfernen Sie die Cochlea. Durchstechen Sie unter einem Dissektionsmikroskop mit fünffacher Vergrößerung das ovale Fenster und entfernen Sie den Steigbügel mit einer scharfen Spitzhacke.
Führen Sie dann einen Pickel in das runde Fenster ein, um die Membran zu durchstechen. Um die Fixierung durchzuführen, decken Sie das geöffnete runde Fenster mit der geschnittenen Spitze eines Infusionssets ab, das an einer mit zwei Millilitern Formalin gefüllten Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist. Ziehen Sie das Formalin langsam über einen Zeitraum von zwei Minuten durch die perilymphatischen Räume einer Cochlea und stellen Sie sicher, dass das Formalin über das geöffnete ovale Fenster aus der Cochlea austritt.
Schneiden Sie überschüssiges Gewebe von der Cochlea ab. Tauchen Sie es in eine Flasche mit 10% Formalin und legen Sie es über Nacht auf einen Rotator. Zur Entkalkung spülen Sie die Cochlea dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS aus.
Tauchen Sie in eine Flasche mit 10% Lösung von EDTA. Inkubieren Sie es vier Tage lang mit Rotation und wechseln Sie die Lösung täglich. Dann die Cochlea dreimal mit PBS durchbluten und zwischen den Wechseln 15 Minuten lang eintauchen, um alle EDTA zu entfernen.
Dehydrieren Sie die Cochlea nach dem Waschen 30 Minuten lang mit aufsteigenden Ethanolkonzentrationen in jeder Konzentration. Färben Sie die gesamte Cochlea durch Eintauchen in Rhodamin-B-Lösung über Nacht mit Rotation. Entfernen Sie überschüssigen Farbstoff von der Cochlea mit zwei Wechseln von 100% Ethanol mit Inkubation für fünf Minuten für jeden Wechsel.
Übertragen Sie die gefärbte Cochlea für jeweils 30 Minuten in zwei Wechsel der Spalteholz-Lösung. Über Nacht in der Klärlösung mit Rotation belassen. Befestigen Sie die Cochlea an einem Probenstab am ovalen und runden Fenstermembranende.
Stellen Sie sicher, dass die Reinigungslösung in der Cochlea verbleibt und sich keine Blasen bilden. Befestigen Sie die ovalen und runden Fensterenden der nassen Cochlea mit UV-aktivierendem Kleber am trockenen Probenstab. Härten Sie den UV-Kleber 10 Sekunden lang aus, indem Sie sich mit UV-Licht um die Cochlea bewegen.
Hängen Sie die Cochlea in die Bildgebungskammer in einer optisch klaren Quarzfluorometerzelle, die mit Spalteholzlösung gefüllt ist, wobei der Probenstab an einem rotierenden Halter befestigt ist, der ebenfalls an der X/Z-Translationsstufe befestigt ist. Verwenden Sie dann ein speziell entwickeltes Programm, um die Probe in den Schritten X-Achse und Z durch das Lichtblatt zu bewegen und einen Stapel von 2D-Bildern in der gesamten Cochlea zu erstellen. Um das Bild zu verarbeiten, übertragen Sie den Bildstapel auf einen anderen Computer und laden Sie ihn zur 3D-Rekonstruktion und Quantifizierung in ein 3D-Rendering-Programm.
Die direkte Volumendarstellung einer Maus-Cochlea zeigte die ovalen und runden Fenster, das Corti-Organ mit Haarzellen, der Rosenthal-Kanal wurde segmentiert und das Volumen gerendert und zeigte spiralförmige Ganglienneuronen (SGNs) entlang seiner Länge. Mit TSSLIM wurde die Cochlea einer drei Monate alten jungen Maus und einer 23 Monate alten Maus abgebildet und für SGNs gezählt. Die SGN-Zellzahlen in Abhängigkeit von der Rosenthal-Kanalabstand, die in einem linearen Diagramm dargestellt ist, zeigten beim jüngeren Tier an den mittleren und apikalen Enden der Cochlea im Vergleich zum älteren Tier größere SGNs.
Dieser scheinbare Verlust von SGNs wurde mit Hilfe von Clusteranalyse und 3D-Rendering-Software visualisiert. Die Unterschiede in der SGN-Dichte wurden auf einer Farbskala dargestellt, bei der Cluster mit hoher Dichte gelb sind und Blau Regionen mit geringerer Dichte darstellt. Die Clusteranalyse zeigte deutlich die Regionen mit geringerer Zelldichte entlang der Länge des Rosenthal-Kanals.
Die Lichtblattmikroskopie wurde entwickelt, um einen gut ausgerichteten Stapel von Bildern zu erzeugen, aus dem 3D-Volumendarstellungen von Strukturen erstellt werden können. 3D-Rendering-Programme ermöglichen die quantitative Beurteilung von Strukturen und anatomischen Beziehungen zwischen verschiedenen Strukturen. Da 3D-Rendering-Programme jedoch viele verschiedene Benutzerparameter bieten, gibt es eine erhebliche Lernkurve, um diese Programme effektiv zu nutzen.
