Dieses Protokoll zeigt, dass die Kombination von Empfindungsboten-RNA-Transaktionen mit impedanzbasierten Echtzeitmessungen der Zellmigration und -invasion die Identifizierung von Genen erleichtert, die die Migration und Invasion von Tumorzellen stimulieren. Das impedanzbasierte Echtzeit-Zellanalysesystem ermöglicht eine quantitative, kontinuierliche und umfassende Überwachung der Tumorzellmigration bei Änderungen der Genexpression. Gene, die Tumore überexprimieren und die Migration von Tumorzellen stimulieren, können als potenzielles Ziel identifiziert werden, um die Metastasierung in der Krebstherapie zu hemmen.
Zu Beginn werden 10 Mikroliter 10x-Reaktionspuffer, 1,5 Mikroliter PNE-Puffer und 10 Mikrogramm einer Plasmid-DNA in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, um die Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym zu linearisieren. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das Reaktionsvolumen auf 100 Mikroliter zu bringen. Mischen Sie es, indem Sie es abklopfen und herunterschleudern, bevor Sie die Reaktionsmischung über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Wieder wird heruntergeschleudert und fünf Mikroliter 10%SDS und ein Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter RNA-Proteinase K in die Reaktionsmischung gegeben, bevor sie gemischt und heruntergeschleudert wird. Nach 30 Minuten Inkubation bei 50 Grad Celsius werden jeweils zwei Mikroliter 10-facher Transkriptionspuffer, ATP, GTP, UTP, CTP und T7 sowie ein Mikrogramm einer linearisierten DNA in ein Mikrozentrifugenröhrchen für die T7-RNA-Polymerase-vermittelte RNA-Synthese gegeben. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das Reaktionsvolumen auf 20 Mikroliter zu bringen.
Nach einem Spin-down wird das Reaktionsgemisch zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius für die RNA-Synthese inkubiert. Als nächstes wird ein Mikroliter DNA hinzugefügt und vor 15 Minuten Inkubation bei 37 Grad Celsius geklopft, um die Template-DNA zu entfernen. Beginnen Sie mit der Lithiumchlorid-Fällung der RNA, indem Sie 10 Mikroliter 7,5-molares Lithiumchlorid zu dem Reaktionsgemisch hinzufügen.
Nach dem Abklopfen und Schleudern wird das Reaktionsgemisch bei minus 20 Grad Celsius für 30 Minuten inkubiert. Zum Verschließen erhitzen Sie die RNA-Probe 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius und legen sie dann zum Abkühlen auf Eis. Als nächstes werden die Komponenten der Verschließreaktion zugegeben und durch Abklopfen gemischt.
Das Reaktionsgemisch wird heruntergeschleudert und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Für Poly-A-Tailing wird die Probe heruntergeschleudert und die Poly-A-Tailing-Reaktionskomponenten hinzugefügt. Dann klopfen, schleudern und das Reaktionsgemisch zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Für die Lithiumchlorid-Fällung und die Quantifizierung der synthetischen mRNA werden 50 Mikroliter 7,5-molares Lithiumchlorid zugegeben und die Lithiumchlorid-Fällung durchgeführt. Nehmen Sie ein Aliquot ECM-Gelbrühe aus dem Gefrierschrank und bewahren Sie es auf Eis auf. Verdünnen Sie das ECM-Gel mit 10 Milligramm pro Liter auf eine Arbeitskonzentration, indem Sie 990 Mikroliter DMEM mit 10 Mikrolitern ECM-Gel in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen.
Durch vorsichtiges Pipettieren mischen. Geben Sie 60 Mikroliter verdünntes ECM-Gel in jede der 16 Vertiefungen der oberen Kammer der CIM-Platte. Legen Sie die obere Kammer der CIM-Platte mit abgenommener Plattenabdeckung für etwa vier Stunden auf eine schützende Kunststofffolie in einem Kohlendioxid-Inkubator, um eine Gelschicht zu bilden.
Für die Elektroporation fügen Sie der Tumorzellsuspension in jedem Röhrchen einen Milliliter DPBS hinzu. Tippen Sie auf die Zellenaufhängung und drehen Sie sie 10 Sekunden lang dreimal nach unten. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
Fügen Sie dem Zellpellet 110 Mikroliter Resuspensionspuffer R hinzu, um 0,1 Millionen Zellen in 10 Mikrolitern zu erhalten. Fügen Sie dem Zellpellet synthetische mRNA hinzu, um je nach gewünschtem Expressionsniveau eine Konzentration von 0,2 bis 20 Nanogramm pro Mikroliter zu erhalten. Mischen Sie das Zellpellet und resuspendieren Sie es vorsichtig durch Klopfen.
Als nächstes werden 10 Mikroliter der Zellsuspension mit einem Elektroporationssystem bei 1.350 Volt für 10 Millisekunden mit jeweils drei Impulsen elektropoliert. Sobald dies erledigt ist, werden die elektroporierten Zellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,1 Millilitern DMEM mit 0,5 % FBS überführt. Öffnen Sie das Analyseprogramm mit einem Doppelklick auf das Symbol der Echtzeit-Zellanalysesoftware.
Nachdem Sie die Standardoption für die Einrichtung von Experimentmustern geöffnet haben, wählen Sie die Option zum separaten Ausführen von drei Experimenten aus. Öffnen Sie jede Ladestation, indem Sie auf die Registerkarte "Nummer" klicken. Klicken Sie als Nächstes auf die Registerkarte Testnotizen.
Wählen Sie den Ordner aus, und speichern Sie die Daten, indem Sie den Namen des Experiments eingeben. Klicken Sie auf die Registerkarte "Layout" und wählen Sie vier Wells gleichzeitig aus, um die Quad-Duplikat-Wells für jede Behandlungsbedingung einzurichten. Geben Sie die Beispielinformationen ein und klicken Sie auf Übernehmen.
Klicken Sie auf die Registerkarte "Zeitplan" und fügen Sie dann einen Schritt hinzu, um den zweistufigen Modus der Zellimpedanzmessungen einzurichten. Klicken Sie dann auf Übernehmen, um den ersten Schritt einzurichten. Klicken Sie erneut auf Schritt hinzufügen und geben Sie 10 Minuten für das Intervall und 48 Stunden für die Dauer der Migration und Invasion ein.
Klicken Sie dann auf Übernehmen, um den zweiten Schritt einzurichten. Eine Stunde vor der Zellimpedanzmessung 160 Mikroliter DMEM mit 10%igem Serum oder anderen Chemolockstoffen in die Vertiefungen der unteren Kammer der CIM-Platte geben. Montieren Sie die obere Kammer mit den gelbeschichteten ECM-Wells für die Invasion oder die unbeschichteten Wells für die Migration mit der unteren Kammer.
Für den Zellmigrationsassay werden 50 Mikroliter niedriges Serummedium in die Vertiefungen der oberen Kammer der CIM-Platte gegeben. Legen Sie die CIM-Platte und die Halterung des Systems in den CO2-Inkubator. Klicken Sie auf die Registerkarte "Nachricht".
Sobald die Verbindung in Ordnung ist, wird die Meldung angezeigt, die CIM-Platte ist bereit für das Experiment. Die montierte CIM-Platte wird vor der Echtzeit-Zellanalyse 30 bis 60 Minuten lang im Kohlendioxid-Inkubator vorinkubiert, um die CIM-Platte an die Kulturbedingungen zu gewöhnen. Klicken Sie für den Baseline-Messwert auf die Startschaltfläche für jede Dockingstation.
Wenn das Fenster "Speichern unter" angezeigt wird, speichern Sie die experimentelle Datei, um den Baseline-Messwert durchzuführen. Für die Zellenbestuhlung nehmen Sie die CIM-Platte aus der Halterung und legen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank auf dem Plattenhalter. Geben Sie dann 100 Mikroliter elektroporierte Zellen mit 100.000 Zellen in die Vertiefungen der oberen Kammer der CIM-Platte und lassen Sie die CIM-Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter der Biosicherheitswerkbank.
Messen Sie die Zellimpedanz, indem Sie die fertig montierte CIM-Platte zurück in die jeweilige Halterung schieben. Beginnen Sie mit der Messung der Zellimpedanz für den zweiten Schritt, indem Sie auf die Schaltfläche "Cradle Start" und auf die Registerkarte "Plotten" klicken. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Alle hinzufügen und aktivieren Sie die Felder Durchschnitt und Standardabweichung, um die Daten in Echtzeit zu visualisieren.
Die Elektroporation von U 118 mg Glioblastomzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von synthetischer Crack-ein-mRNA führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg des Flag-markierten Crack-A-Proteins einen Tag nach der Transfektion. 0,2 und zwei Nanogramm pro Mikroliter mRNA führten zu einer nicht nachweisbaren oder bescheidenen Expression des exogenen Crack-One-Proteins. 20 Nanogramm pro Mikroliter mRNA führten zu einer höheren Expression als das endogene Crack-One-Protein.
Der Zellmigrationsassay zeigte, dass die Elektroporation 0,2 oder zwei Nanogramm pro Mikroliter Riss betrug, eine mRNA hatte keinen großen Einfluss auf die Zellmigration. Die Elektroporation mit 20 Nanogramm pro Mikroliter Crack-1-mRNA führte jedoch zu einer deutlichen Stimulation der Zellmigration, wobei zwischen zwei und 13 Stunden mehr Zellen migrierten, was zeigte, dass die Glioblastom-Zellmigration durch die Erhöhung des Crack-One-Proteinspiegels stimuliert wurde. Die Elektroporation mit synthetischer Crack-L-mRNA führte zu einer robusten Expression des Flaggen-markierten Crack-L-Proteins einen Tag nach der Transfektion.
Die Invasion der Kontrollzellen verlangsamte sich mit der erhöhten EZM-Proteinkonzentration. Crack L über exprimierenden Zellen zeigte eine von der ECM-Gelkonzentration abhängige Abnahme der Zellinvasion. Der Vergleich zwischen der Kontroll- und der Crack-L-Expression von Zellen bei unterschiedlichen ECM-Gel-Konzentrationen zeigte, dass die Überexpression von Crack L im Allgemeinen die Zellinvasion durch die ECM-Gelschicht stimulierte.
Die Ergebnisse deuteten auch darauf hin, dass die beiden Zellpopulationen durch eine Erhöhung der EZM-Gelkonzentration zu unterschiedlichen Zeitpunkten unterschiedlich beeinflusst wurden. Zellen sollten schnell, schonend und vollständig in der resuspendierten Blase R resuspendiert werden, da eine lange Inkubation von Zellen in der resuspendierten Blase R die Zellen ungesund macht. Schnell und langsam migrierende Tumorzellen können isoliert werden, um Unterschiede zwischen den beiden Zellpopulationen zu charakterisieren.
