Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Anzahl der Kopien der mitochondrialen DNA in einzelnen Zellen und das Niveau bestimmter Arten von mitochondrialen DNA-Mutationen genau zu messen. Bisherige Methoden können diese Messungen in Gewebeproben, die viele Zellen enthalten, genau durchführen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir die gleichen Messungen in einzelnen Zellen durchführen können.
Diese Methode ist besonders nützlich für diejenigen, die Mitochondrien studieren und wird breite Anwendungen in diesem Bereich haben. Die effektive Isolierung und Lyse einzelner Zellen ist der Schlüssel zu dieser Technik. Vorherige Erfahrungen mit der Einzelzellsortierung wären sehr hilfreich.
Um zu beginnen, bereiten Sie den Mastermix für die PCR ohne die Proben-DNA auf Eis vor, wie im Text beschrieben. Nach dem kurzen Durchtexen verteilen Sie das erforderliche Volumen der vorbereiteten Mastermischung auf jede Vertiefung einer PCR 96-Well-Platte zur Tröpfchenerzeugung und ordnen die Proben in vollen Spalten an. Fügen Sie als Nächstes die Mastermischung jedem leeren Feld in unvollständigen Spalten hinzu, um sie als Nicht-Vorlagensteuerelemente zu verwenden.
Fügen Sie dann die Eingangs-DNA zu jeder Vertiefung hinzu, um das Gesamtvolumen jedes Bohrlochs auf 22 Mikroliter zu erhöhen. Verschließen Sie die Platte mit einer Klebeplattendichtung und legen Sie sie eine Minute lang bei 2000 U/min auf einen Shaker. Dann zentrifugieren Sie die Platte bei 1000 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius, bevor Sie sie auf Eis legen.
Stellen Sie bei der Tröpfchenerzeugung zunächst sicher, dass der Tröpfchengenerator eingeschaltet ist, und prüfen Sie, ob eine Flasche tröpfchenerzeugendes Öl an Position E des Instrumentendecks geladen ist. Klicken Sie dann auf dem Touchscreen auf Configure Sample Plate. Nachdem Sie alle Spalten auf der Probenplatte mit den Proben oder Leerproben ausgewählt haben, klicken Sie auf OK, um die Plattenkonfiguration zu bestätigen.
Als nächstes laden Sie die Tröpfchengeneratorpatronen auf Position B auf dem Instrumentendeck, so dass alle Lichter grün werden, und legen Sie einen leeren Kippmülltrog in Position C.Laden Sie dann Filterspitzenboxen mit entfernten Deckeln auf Position D auf dem Instrumententisch, so dass alle Lichter grün werden. Als nächstes entfernen Sie die Klebedichtung, bevor Sie die Probenplatte an Position F des Instrumentendecks laden, so dass das Licht grün wird. Laden Sie auch eine leere 96-Well-Platte, die in einen kühlen Block gelegt wird, der bei minus 20 Grad Celsius an Position G vorgekühlt ist, so dass das Licht grün wird.
Klicken Sie auf dem Touchscreen des Instruments auf Tröpfchengenerierung starten, und der Deckel des Tröpfchengenerators schließt sich automatisch. Sobald die Tröpfchenerzeugung abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Probenentnahmeplatte visuell, um zu bestätigen, dass in jedem Bohrloch eine Tröpfchenemulsionsschicht über der Ölphase vorhanden ist. Als nächstes schalten Sie die Plattenversiegelung ein und stellen die Temperatur auf 180 Grad Celsius und die Versiegelungszeit auf fünf Sekunden ein.
Lassen Sie die Maschine die Betriebstemperatur erreichen. Legen Sie dann die Probenentnahmeplatte auf den Plattenhalter des Plattenversiegelers und legen Sie eine frische Foliendichtung mit der roten Linie nach oben auf die Platte. Wenn die Plattenversiegelung ihre Betriebstemperatur erreicht hat, drücken Sie auf dem Touchscreen des Instruments auf Auswurf.
Nachdem Sie den Plattenhalter in die Schublade der Plattenversiegelung gelegt haben, drücken Sie das Siegel, um die Schublade zu schließen. Sobald die Versiegelung abgeschlossen ist, öffnet sich die Schublade automatisch. Entfernen Sie die versiegelte Platte und legen Sie sie auf den kalten Block.
Schalten Sie dann die Plattenversiegelung aus. Um die PCR auszuführen, legen Sie die versiegelte Tröpfchensammelplatte in ein PCR-Gerät mit einem 96-Tiefbrunnenblock. Schalten Sie nach Abschluss der PCR den Tröpfchenleser und den angeschlossenen Computer ein.
Laden Sie die Platte mit den Post-PCR-Proben in den Plattenhalter des Tröpfchenlesers. Während Sie den Foliendeckel auf der Probenplatte halten, legen Sie die Abdeckung auf die Oberseite der Halterung und sichern Sie sie mit schwarzen Verriegelungsclips. Um den Deckel des Tröpfchenlesers zu öffnen, drücken Sie anschließend die Öffnungs-/Schließtaste.
Laden Sie dann den Tröpfchen-Reader-Plattenhalter mit der Probenplatte in die Lesekammer und legen Sie ihn sicher auf den Magnetfuß. Drücken Sie erneut die Öffnungs-/Schließtaste, um den Deckel zu schließen. Öffnen Sie die Schnittstelle der Analysesoftware.
Wählen Sie die Registerkarte Platte hinzufügen aus, klicken Sie auf Platte hinzufügen, und klicken Sie dann auf Platte konfigurieren. Geben Sie auf der Registerkarte Platteninformationen einen Plattennamen ein, wählen Sie Supermix für Sonden, Kein DUTP aus dem Dropdown-Menü Supermix aus, und geben Sie einen Dateinamen unter Datendatei speichern As.In der Registerkarte Bohrlochauswahl ein, markieren Sie die zu analysierenden Vertiefungen und klicken Sie auf Ausgewählte Vertiefungen einschließen. Wählen Sie dann auf der Registerkarte Bohrlochinformationen die Bohrlöcher aus, die mit Anmerkungen versehen werden sollen.
Wählen Sie im Dropdown-Menü Experimenttyp die Option Direkte Quantifizierung aus. Füllen Sie dann die Felder Probenbeschreibung, Probentyp und Zielname aus, und fügen Sie bei Bedarf Bohrlochnotizen und/oder Plattennotizen hinzu. Klicken Sie dann auf Übernehmen.
Sobald die Plattenkonfiguration abgeschlossen ist, klicken Sie auf Start Run. Wählen Sie für die Ergebnisanalyse die Registerkarte Datenanalyse und öffnen Sie die zu analysierende Datei im Menü Meine Datendateien. Klicken Sie dann auf die Registerkarte 1D-Amplitude für einfarbige Experimente oder die Registerkarte 2D-Amplitude für zweifarbige Experimente.
Wählen Sie als Nächstes die Vertiefungen aus, für die ein Schwellenwert erforderlich ist. Verwenden Sie das Werkzeug Schwellenwertlinienmodus, um den Schwellenwert manuell in den freien Raum zwischen den positiven und negativen Grundgesamtheiten im Amplitudendiagramm anzuwenden, und stellen Sie sicher, dass das Fadenkreuz so platziert wird, dass die vier Tröpfchenpopulationen deutlich voneinander getrennt sind. Sobald der Schwellenwert für alle Proben angewendet wurde, exportieren Sie die Ergebnisse zur weiteren Analyse als CSV-Datei, indem Sie auf die Registerkarte Datentabelle, Importieren/Exportieren, klicken und Sichtbare Daten in CSV exportieren auswählen.
Geben Sie einen geeigneten Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern. Die in diesem Protokoll verwendeten PCR- und Tröpfchenleseverfahren zeigten das Vorhandensein klar getrennter Populationen positiver und negativer Tröpfchen, sowohl im Fam- als auch im Hex-Kanal. Mitochondriale DNA-Populationen, die für beide Sonden positiv waren, konnten auch von Einzelzelllysaten unterschieden werden.
Diese Methode zeigte auch, dass für Proben mit Deletionen in der mitochondrialen DNA eine gemischte Population von doppelt positiven Tröpfchen und Tröpfchen vorhanden ist, die nur für den nicht gelöschten Teil der DNA positiv sind. Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um die mitochondriale DNA-Kopienzahl pro Zelle in einer Vielzahl von Säugetierzellen, einschließlich Mauseizellen und primären embryonalen Zellen der Maus, zu zählen. Darüber hinaus wurde in Zellen mit hoher Deletionsheteroplasmie festgestellt, dass die Population, die für eine einzelne Sonde positiv war, signifikant größer war als die doppelt positive Population.
In Zellen mit Heteroplasmatik mit niedriger Deletion waren beide Populationen jedoch von ähnlicher Größe. Daher stellen genaue Ergebnisse immer sicher, dass die Tröpfchenerzeugung erfolgreich war und dass der Schwellenwert mithilfe der 1D- oder 2D-Amplitudenansicht entsprechend angewendet wurde. Unverwendetes Lysat kann für andere Einzelzellassays wie Pyrosequenzierung verwendet werden, die Einzelnukleotid-Polymorphismus-Heteroplasmen messen können.
Die Entwicklung dieser Technik hat es uns ermöglicht, genaue Messungen der mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen durchzuführen, was bisher nicht möglich war.
