Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es uns ermöglichte festzustellen, ob eine Patientenprobe pathogene Antikörper enthielt. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Fähigkeit, die Reaktivität zwischen Oberflächen- und intrazellulären Antigenen zu unterscheiden, die mit anderen Methoden nicht leicht unterschieden werden können. Die kulturellen Hippocampus-Neuronen werden verwendet, um neue Antikörper zu identifizieren.
Die Identifizierung dieser neuen Antikörper ermöglicht schließlich die Einleitung einer spezifischen Monotherapie, um die Patientenergebnisse zu verbessern. Diese Technik ist wichtig, weil sie auf das gesamte Gebiet der Krankheiten ausgedehnt werden kann, die mit pathogenen Antikörpern zusammenhängen, die gegen neuronale Oberflächenproteine gerichtet sind. Halten Sie den Embryokopf mit einer fein gebogenen Pinzette und durchstechen Sie die Orbita mit einer feinen geraden Pinzette in einem Winkel von 45 Grad.
Lassen Sie dann die fein gebogene Pinzette los. Mit Hilfe einer Operationsschere sezieren Sie die Haut und den Schädel vom Hinterhauptsknochen bis zum Stirnbein. Dann entfernen Sie das Gehirn mit einer fein gebogenen Pinzette und sammeln Sie es in der sechs Zentimeter großen Schale mit Winterschlaf plus B27.
Sobald die Gehirne aller Embryonen wiederhergestellt sind, verwenden Sie die feine gerade Pinzette, um die Telencephalons sagittal zu trennen. Als nächstes bereiten Sie eine 10-Zentimeter-Schale vor, indem Sie Tropfen Winterschlaf plus B27 in einem Abstand von einem Zentimeter in einen Kreis legen und ein Telencephalon pro Tropfen platzieren, um durch das Sezierfernrohr bei einer 1,25-fachen Vergrößerung zu visualisieren. Während Sie unter dem Mikroskop arbeiten, entfernen Sie vorsichtig den Thalamus und schälen Sie die Hirnhäute, um den Hippocampus besser zu visualisieren.
Anschließend sezieren Sie den Hippocampus mit der Präzisionsfederschere. Und legen Sie es in die 3,5-Zentimeter-Schale mit Hibernate plus B27 und istrate zwei. Wiederholen Sie den Vorgang, um alle Hippocampi zu sammeln.
Für die enzymatische Dissoziation des Hippocampus fügen Sie einen Milliliter 2,5% Trypsin in das 50-Milliliter-Röhrchen mit den Hippocampi hinzu. Nachdem Sie das Volumen in der Röhre mit HBSS auf fünf Milliliter gebracht haben, inkubieren Sie das Röhrchen für 15 Minuten im Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Um das Trypsin weiter zu verdünnen, fügen Sie 10 Milliliter vorgewärmtes HBSS hinzu und legen Sie das Röhrchen wieder in das Wasserbad, das fünf Minuten lang auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.
Als nächstes verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Mikropipette, um die als Schleimmasse erscheinenden Hippocampi in ein 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Und inkubieren Sie das Gewebe mit sechs Milliliter vorgewärmtem HBSS für fünf Minuten, wie gezeigt. Um das Gewebe mechanisch zu dissoziieren, übertragen Sie die Hippocampus-Masse in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit konischem Boden.
Nach Zugabe eines Milliliters vorgewärmter DMEM-Medien homogenisieren Sie das Pellet mit einer 1000-Mikroliter-Mikropipette durch vorsichtiges Ansaugen auf und ab. Um keine Blasen zu erzeugen, wiederholen Sie die Auf- und Abaspiration 10 bis 20 Mal mit einer vorgezogenen Glaspipette, deren Spitze mit dem konischen Boden des Rohres in Kontakt kommt, bis die Mischung durchscheinend ist. Zählen Sie die Zellen, bevor Sie sie gleichmäßig auf einer 3,5 Zentimeter großen Schale mit gekreuzten Schüttelbewegungen verteilen.
Sobald Sie fertig sind, stellen Sie die Schale mit 5% Kohlendioxid in den Inkubator. Für die fluoreszierende Immunfärbung von 14-tägigen In-vitro-Zellen fügen Sie die Probe mit Anti-NMDAR-Antikörpern zu den Deckblättern hinzu und inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nach einer Stunde wird die Probe fünf Minuten lang mit 4% Formaldehyd und PBS als Fixierungslösung bei Raumtemperatur behandelt.
Dann waschen Sie den Probenschub jeweils fünf Minuten lang mit PBS, gefolgt von der Zugabe des sekundären Antikörpers Ziege gegen den Menschen Alexa Fluor 488 in einer bis 1000 Verdünnung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Als nächstes montieren Sie die Abdeckgläser mit der Probe mit einem flüssigen Montagemedium und saugen Sie die restliche Flüssigkeit ab. Visualisieren Sie die Neuronen mit Fluoreszenzbildgebung.
Verwenden Sie für die Kalziumbildgebung 14 bis 18 Tage in vitro Zellen, die auf Deckblättern gezüchtet wurden. Vor der Bildgebung behandeln Sie die Zellen mit dem viralen Vektor, der für pAAV2 CAG GCaMP 5G kodiert, bei 2,5 mal 10 bis 10. Genomkopien pro Milliliter für fünf bis sieben Tage. Einen Tag vor der Bildgebung inkubieren Sie die Zellen mit der Patientenprobe für 24 Stunden.
Bereiten Sie am Imaging-Tag den Aufbau vor und stellen Sie die Mikroskopzellkammer auf 37 Grad Celsius ein. Füllen Sie die Spur mit destilliertem Wasser, infundiert mit 5% Kohlendioxid, um die physiologischen Bedingungen der Zelle aufrechtzuerhalten. Nachdem Sie die Zellen mit extrazellulärer physiologischer Lösung bedeckt haben, übertragen Sie sie in die Mikroskopzellkammer.
Fügen Sie 10 mikromolare NBQX hinzu, um die AMPA- und KA-Rezeptoren zu blockieren, und visualisieren Sie die NMDA-Rezeptorantwort. Erfassen Sie den Film von vier Minuten mit den Bildern, die alle 100 Millisekunden aufgezeichnet werden. Kurz nach Beginn der Erfassung Stimulationslösung in die Schale geben.
Nach der Stimulation extrahieren Sie das fluoreszierende Signal im Laufe der Zeit aus der Kultur, die mit der Kontrolle inkubiert wurde, und den zerebralen Rückenmarksflüssigkeits- oder Liquorproben des Patienten unter Verwendung von Verarbeitungssoftware wie Image J.It wurde beobachtet, dass die Zellen an einem Tag in vitro gleichmäßig verteilt waren und an der Platte hafteten, wobei sich eine Lamelle um den Zellkörper herum entwickelte und kleinere Neuriten begannen, sich auszudehnen. Nach einigen Tagen in Kultur dehnten sich die Neuriten eine kurze Strecke aus und die Zellen zeigten eine signifikante Polarisation. Das neuronale Netzwerk wuchs weiter und wurde komplex.
Nach 18 Tagen waren die Neuronen reif, miteinander verbunden und bauten das neuronale Netzwerk auf. Die repräsentativen fluoreszierenden Bilder zeigen reife Neuronen nach 18 Tagen mit selektiven Markern. Die Inkubation der Kulturen mit den Patientenproben erzeugte ein intensives Fluoreszenzsignal, da es die Autoantikörper enthält, die den NMDA-Rezeptor auf der Oberfläche der Neuronen erkannten.
Im Gegensatz dazu erzeugten die Kontrollproben kein Fluoreszenzsignal, wenn sie den neuronalen Kulturen verabreicht wurden. Die Anwendung von NMDA erhöhte die Fluoreszenzintensität, was durch eine Veränderung der intrazellulären grünen Fluoreszenz angezeigt wird. Wenn der Stimulator angewendet wurde, zeigten die Neuronen, die mit der Kontroll-Liquorprobe behandelt wurden, einen höheren Unterschied in der Fluoreszenzintensität als die Zellen, die mit der Liquorprobe des Patienten behandelt wurden.
Die Eigenschaftsidentifikation und Dissektion des Hippocampus bestimmen die Reinheit der Kulturen. Die Zellaggregation ist ein Schlüsselfaktor, insbesondere bei der Verwendung der Kulturen für bildgebende Zwecke. Darüber hinaus können kultivierte Hippocampus-Neuronen verwendet werden, um neuartige Antikörper und ihre Zielantigene zu identifizieren, wenn sie mit Immunpräzipitations- und Massenspektrometrietechniken kombiniert werden.
Diese Technik hat die Charakterisierung einer neuen Kategorie von Antikörper-vermittelten Krankheiten ermöglicht. Daher ist es für das Studium des neuartigen Gebiets der Nanoimmunologie unerlässlich.
