Dieses Protokoll ermöglicht es, Proteine zelltypspezifisch zu markieren. Dies ist die erste Technik, die eine solche Möglichkeit bietet, und sie kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass die markierten zelltypspezifischen Proteine unidentifiziert gereinigt oder in situ durch Immunfluoreszenz sichtbar gemacht werden können.
Um mit der Vorbereitung des Gewebelysats zu beginnen, wird ein Lysepuffer mit einem Volumen von 12 bis 15 mal dem Nassgewicht des Gewebes hinzugefügt und das Gewebe trituiert, bis es homogenisiert ist. Erhitzen Sie dieses Homogenat für 15 Minuten auf 75 Grad Celsius, um das Protein zu denaturieren, zentrifugieren Sie dann die Probe und übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Diese Probe kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.
Anschließend wird die homogenisierte Probe zur Alkylierung zwei- bis dreimal in einem Phosphatsalzpuffer verdünnt, der einen EDTA-freien Proteaseinhibitor enthält. Dann fügen Sie frisch zubereitetes Jodoacetamid zu einer Endkonzentration von 20 Millimol hinzu. Lassen Sie die Probe ein bis zwei Stunden bei 20 Grad Celsius im Dunkeln.
Wiederholen Sie die Schritte der Iodoacetamid-Addition und -Inkubation zweimal. Bereiten Sie die Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, indem Sie zuerst die Säulen wirbeln. Dann den Deckel entfernen, den unteren Teil schneiden und zentrifugieren.
Führen Sie als Nächstes einen Pufferaustausch durch, indem Sie zuerst die Pufferaustauschsäulen mit dem Klickchemieaustauschpuffer ausgleichen und dann alle alkylierten Proben austauschen. Um den Azidonorleucin-Einbau zu bewerten, nehmen Sie 40 Mikroliter der angedeuteten Probe und fügen Sie Phosphatsalzlösungspuffer zu einem Endvolumen von 120 Mikrolitern hinzu. Richten Sie dann die Klickchemiereaktion ein, indem Sie die Reaktion 20 Sekunden lang durchwirbeln.
Nachdem Sie jedes Reagenz in der angegebenen Reihenfolge so schnell wie möglich hinzugefügt haben, inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei vier Grad Celsius über Nacht mit kontinuierlicher Rotation. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Proben für fünf Minuten bei 17.000 mal G nach der Zentrifugation wird ein leicht türkisfarbenes Pellet sichtbar sein. Den Überstand in ein neues Röhrchen überführen und die Probe bei minus 80 Grad Celsius lagern.
Zur markierten Proteinreinigung. Alle Proben werden einem Pufferaustauschverfahren unterzogen, wie gezeigt, um Reste von freiem Alkin unter Verwendung eines Neutravidin-Bindungspuffers als Gleichgewichtspuffer zu reinigen. Dann waschen Sie die Neutravidin-Hochleistungsperlen dreimal, indem Sie die Perlen mit dem Bindepuffer mischen.
Zentrifugieren Sie die Mischung, verwerfen Sie den Überstand und wiederholen Sie dies dreimal. Dann bereiten Sie eine Eins-zu-Eins-Aufschlämmung vor, indem Sie das gleiche Volumen an Neutravidin-Trockenkügelchen und Neutravidin-Bindungspuffer hinzufügen. Von jeder Probe werden 20 bis 40 Mikroliter als vorgereinigtes Lysat beiseite gelegt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert.
Nach der Messung der Proteinkonzentration der Probe mischen Sie ein Milligramm Protein mit 40 Mikrolitern der Perlenaufschlämmung. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius mit kontinuierlicher Rotation, so dass die markierten Proteine an die Perlen binden können. Am folgenden Tag sammeln Sie den Überstand durch Zentrifugieren.
Legen Sie ein Aliquot von 20 bis 40 Mikrolitern des Überstands für eine spätere Analyse beiseite und frieren Sie den Rest bei minus 80 Grad Celsius ein. Als nächstes waschen Sie die Perlen dreimal, indem Sie gekühlten Neutravidin-Waschpuffer hinzufügen. Sedimentieren der Perlen und Verwerfen des Überstands.
Dann fügen Sie den gleichen Puffer hinzu und brüten Sie die Perlen für 10 Minuten unter kontinuierlicher Rotation bei vier Grad Celsius aus, bevor Sie den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie die Wäsche mit den Neutravidin-Waschpuffern zwei und drei und eluieren Sie die angeklickten Proteine, indem Sie die Perlen 30 Minuten lang bei 20 Grad Celsius mit einem Volumen Neutravidin-Elutionspuffer inkubieren, das einem Volumen der verwendeten Trockenkügelchen entspricht. Während der Elution die Perlen bei 1000 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoblock-Shaker zweimal in Schwebe halten und beide Elue kombinieren.
Klickreaktionen wurden mittels SDS-Seite und Western Immuno Blot analysiert. Repräsentative Bilder der Experimente werden für die Azidonorleucin-Verabreichung durch intraperitoneale Injektion und für die Azidonorleucin-Verabreichung über Trinkwasser gezeigt. Ein weiteres Experiment liefert ein Beispiel für die Bestimmung der optimalen Disulfidbiotin-spaltbaren Alkinkonzentration.
In diesem Beispiel ist die Faltenänderung zwischen der markierten Probe und der Kontrolle bei 14 Mikromolalkinkonzentrationen am höchsten. Ein Beispiel für ein massenspektrometrisches Ergebnis mit einer deutlichen Anreicherung in der mit Azidonorleucin markierten Probe im Vergleich zur Kontrolle ist hier gezeigt. Dieser Unterschied war bereits in der gesamten Proteinfärbung sichtbar.
Neben Änderungen der Peptidintensität finden sich in beiden Proben auch einzigartige Proteine. Dies ist ein technisch komplexes Protokoll und es ist ein Schritt, der sorgfältig unter Verwendung geeigneter Negativkontrollen der Alkylierung, der ordnungsgemäßen (undeutlichen) und angemessenen Reinigung des Nicht-Klick-Archivs befolgt werden muss. Unsere wichtigsten Schritte in diesem Protokoll, gereinigte Proteine können entweder durch Massenspektrometrie identifiziert werden, wenn die Forscher daran interessiert sind, Proteine zu untersuchen, oder sie in ein Gel laden, um Proteine von Interesse durch Western Blot zu untersuchen.
Die Fähigkeit dieser Methode, Proteine eines bestimmten zellulären Ursprungs zu markieren, hat viele Anwendungen wie die Spannung von Proteinen oder die Untersuchung der Proteinsynthese in vitro oder in vivo.
