Verwendung von Crystal Violet zur Verbesserung des visuellen zytopathischen Effekt-basierten Lesens für die virale Titration mit TCID50-Assays

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Virusbestandstitration zu erzeugen und sie durch Kristallviolettfärbung zu visualisieren. Dazu wird eine allgemeine virale Titration demonstriert, gefolgt von der Färbung. Diese Titration wird in einer 96-Well-Platte für einen Zeitraum von sieben Tagen in einer Biosicherheitswerkbank innerhalb eines Labors der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt.

Dazu wird eine 96-Well-Platte der bevorzugten Zelllinie unter Verwendung des entsprechenden Mediums ausgesät und bis zum Zusammenfluss wachsen lassen. Der Virusbestand wird mit zehnfachen Verdünnungen verdünnt, indem 900 Mikroliter Medien und 100 Mikroliter Virus oder die entsprechende Verdünnung gemischt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie jedes Röhrchen wirbeln, um eine ordnungsgemäße Vermischung des Mediums und des Virus zu gewährleisten und Fehler bei den Verdünnungen zu vermeiden.

Schreiben Sie das Layout Ihrer Platte in den Lead sowie jede Verdünnung, um während des Infektionsprozesses zu helfen. Vor der Infektion mit 200 Mikrolitern PBS waschen. Fügen Sie 50 Mikroliter Ihres Inokulums in die entsprechenden Vertiefungen hinzu.

Dann sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius in einem 5% CO2-Inkubator inkubieren. Nach der siebentägigen Inkubation mit 200 Mikrolitern PBS waschen. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 50 Mikroliter pro Vertiefung PFA bei 4% in PBS hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach der Inkubation die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern PBS waschen, bevor 50 Mikroliter pro Vertiefung Kristallviolett in Wasser zugegeben werden, und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zum Schluss Kristallviolett aus den Vertiefungen absaugen und optional die Platten zwei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen lassen oder mit 200 Mikrolitern Wasser waschen, um übermäßige Flecken vor der Visualisierung zu entfernen. Infolgedessen werden nach der erneuten Färbung negative Zellen gefärbt.

Positive Brunnen werden gerodet. Diese Informationen werden in einer der beiden beschriebenen Formeln verwendet, um Ihren endgültigen Virustiter zu berechnen. Wenn der mit jeder Methode erhaltene Titer verglichen wurde, zeigte sich, dass in der Monozytochemie die Färbung in einigen Fällen zusätzliche positive Vertiefungen im Vergleich zu Kristallviolett erkennen konnte, und dass beide Färbemethoden auch mehr positive Vertiefungen erkennen konnten als die visuelle Bewertung durch Mikroskopie.