Dieses Protokoll verwendet die Brechungsindexerkennung, um Nebenprodukte des Kohlenstoffstoffwechsels zu messen, die üblicherweise in lysatbasierten, zellfreien Systemen akkumuliert werden. Es nutzt auch die Massenspektrometrie, um ein noch breiteres Panel zentraler Metaboliten nachzuweisen, die in metabolisch aktiven Lysaten erzeugt werden. Die beiden in diesem Protokoll verwendeten Techniken bieten die Möglichkeit, die chemischen Reaktionen, die in einem lysatbasierten, zellfreien System ablaufen, quantitativ zu beschreiben, was es ermöglicht, eine breitere Palette von Metaboliten nachzuweisen, einschließlich solcher, die in niedrigen Konzentrationen im komplexen Lysathintergrund vorhanden sind.
Jaime Lorenzo Dinglasan und David Reeves, Diplomforscher der Biosciences Division, demonstrieren die Verfahren. Beginnen Sie mit der Kombination der verschiedenen Komponenten in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um endgültige Reaktionen mit 4,5 Milligramm pro Milliliter Gesamtlysatprotein vorzubereiten. Bereiten Sie zellfreie Metabolic Engineering- oder CFME-Reaktionen mit Endvolumina von 50 Mikrolitern in dreifacher Ausfertigung pro Zeitpunkt vor.
Beenden Sie die dreifachen Reaktionen zu den richtigen Zeitpunkten sofort, indem Sie dem endgültigen Reaktionsvolumen jeder Probe ein gleiches Volumen von 5% Trichloressigsäure hinzufügen. Dann verdünnen Sie jede Probe, indem Sie jedem Reaktionsgemisch das Zweifache des Volumens an sterilem Wasser hinzufügen. Um die Zeit Null zu rekapitulieren, mischen Sie das gleiche Volumen von 5% Trichloressigsäure wie das gesamte Endreaktionsvolumen mit dem Lysat, bevor Sie den Rest der Reaktionskomponenten hinzufügen.
Dieser Säuerungsschritt löst Lysatenzyme aus, bevor sie Glukose signifikant verstoffwechseln. Wirbeln Sie die Proben und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang auf einer Mikrozentrifuge auf dem Tisch mit 11.600 g und übertragen Sie die Überstände, die die organischen Analyten enthalten, in saubere Röhrchen. Lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius, wenn später HPLC-Analysen durchgeführt werden sollen.
Stellen Sie sicher, dass Sie die gelagerten Proben auf Eis auftauen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Filtern Sie jeden Überstand mit einem 0,22-Mikrometer-Porenfilter. Nach der Zentrifuge jedes Filtrat in eine saubere HPLC-Glasfläschchen geben.
Legen Sie die Fläschchen auf das Autosampler-Fach des HPLC-Systems, das bereits für die Analyse eingerichtet wurde. Wählen Sie in der Menüleiste Sequenz, Neue Sequenzvorlage aus. Wählen Sie Sequenz aus.
Sequenzvorlage als Sequenzvorlagennamen speichern S.Wählen Sie Sequenz, Sequenztabelle. Hängen Sie N Zeilen an, die N Fläschchen entsprechen. Geben Sie dann die Positionen der Durchstechflasche und die Probennamen unter Der durchstechflasche bzw. Probenname entsprechend ihrer Anordnung auf dem Autosampler-Fach ein.
Wählen Sie die im Manuskript beschrieben generierte Methode aus dem Dropdown-Menü Methodenname aus und geben Sie 50 Mikroliter als Injektion pro Durchstechflasche für jede Zeile ein. Klicken Sie auf Übernehmen, und speichern Sie die Sequenzvorlage, indem Sie Sequenz, Sequenzvorlage speichern auswählen. Stellen Sie sicher, dass die Sequenzvorlage geladen ist, indem Sie Sequenz, Sequenzvorlage laden, Sequenzvorlagenname S auswählen.Nachdem Sie eine stabile Baseline auf dem Online-Plot erreicht haben, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bedienfeld RID-Modul, Steuerung, Aus Recyclingventil, um den Lösungsmittelfluss durch den RID-Detektor zum Abfall zu leiten.
Um die Datenerfassung zu starten, wählen Sie in der Menüleiste Sequenz und dann Sequenztabelle, Ausführen aus. Wählen Sie im Menü Ansicht die Option Datenanalyseansicht aus. Suchen Sie den Namen der Sequenzdatei aus der Dateiliste auf der linken Seite des Bildschirms.
Wechseln Sie im mittleren Bereich des Bildschirms zu Signalansichtsauswahl, RID-Signal, um die Beispielchromatogramme anzuzeigen. Wählen Sie im oberen Bereich des Bildschirms eine Zeile aus, die einem der Beispiele entspricht. Peaks, die den Zielanalyten entsprechen, werden entlang der Retentionszeitachse als Glukose, Succinat, Laktat, Formiat, Acetat und Ethanol in Proben angeordnet, in denen alle diese Metaboliten vorhanden sind.
Erkennen Sie, ob die Peaks of Interest von der Software gut integriert sind. Eine rote Linie sollte automatisch als Basis jedes Peaks gezeichnet werden. Wenn die rote Linie schief ist, ist die automatische Integration fehlgeschlagen.
Wählen Sie dann die Schaltfläche Manuelle Integration aus dem Integration Tool Set und zeichnen Sie manuell eine Peak-Basis, um den Peak-Bereich zu integrieren. Wählen Sie das Cursor-Werkzeug aus dem Common Tool Set aus, um auf richtig integrierte Peaks zu klicken. Der Peak-Bereich und die entsprechende Reaktionszeit des ausgewählten Peaks werden als Tabellenzeile im unteren Bereich des Bildschirms hervorgehoben.
Um Spitzenbereiche zu exportieren, wählen Sie Datei, Exportieren, Integrationsergebnisse. Zeichnen Sie Spitzenflächenwerte im Vergleich zu bekannten Konzentrationen von Proben in einer Tabelle auf. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die dargestellten Daten, und wählen Sie dann Trendlinie hinzufügen, Trendlinie formatieren, Formel im Diagramm anzeigen aus.
Verwenden Sie in einer separaten Tabelle die Gleichungen der Standardkurventrendlinien, um Spitzenflächenwerte für jeden Analyten aus jeder Probe in Konzentrationen umzuwandeln. Berechnen Sie die durchschnittlichen Spitzenbereiche und Standardfehlerwerte über Triplikate hinweg für die Datenvisualisierung. Richten Sie dreifache Reaktionen pro Zeitpunkt, außer Zeit Null, auf Eis ein, wie im Manuskript beschrieben.
Verwenden Sie anstelle von Glukose eine Endkonzentration von 100-Millimolar-Glukose-13C6 in den Reaktionen. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für eine, zwei und drei Stunden. Um mit der Analyse zu beginnen, pipetieren Sie jeder Probe ein äquivalentes Volumen des Extraktionslösungsmittels.
Wenn die Proben eingefroren wurden, fügen Sie das Extraktionslösungsmittel hinzu, bevor die Proben vollständig auftauen, um die Reaktivierung des Glukosestoffwechsels zu verhindern. Führen Sie alle Probenverarbeitungsschritte auf Eis durch. Um die Zeit Null zu rekapitulieren, pipetten Sie das Endvolumen des Extraktionslösungsmittels auf ein geeignetes Lysatvolumen für die gewünschte Endkonzentration von 4,5 Milligramm pro Milliliter in 50 Mikroliter Reaktionsvolumen.
Fügen Sie den Rest der Reaktionskomponenten wie zuvor beschrieben hinzu. Dieser Säuerungsschritt löst Lysatenzyme aus, bevor sie Glukose signifikant verstoffwechseln. Inkubieren Sie die Proben in Extraktionslösungsmittel auf Eis für 30 Minuten unter sanftem Schütteln.
Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 21.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um den Überstand vom gefällten Protein zu trennen. 50 Mikroliter des Überstands in Autosampler-Fläschchen geben und die Fläschchen innerhalb des vier Grad Celsius Autosamplers auf das Fach legen. Nachdem Sie das Gerät für die Analyse vorbereitet haben, richten Sie eine Laufsequenz mit der Datenerfassungs- und Interpretationssoftware des LC-MS/MS-Systems ein.
Klicken Sie in Roadmap, Sequence Setup mit der rechten Maustaste auf die Tabelle, um so viele Zeilen wie Beispiele einzufügen. Stellen Sie für jede Reihe das Injektionsvolumen auf fünf Mikroliter und die Position auf die jeweilige Position der Durchstechflasche auf dem Autosampler-Fach ein. Geben Sie Dateinamen als Beispielnamen ein und legen Sie den gewünschten Dateipfad für die Ausführungsergebnisse fest.
Um den Lauf zu starten, markieren Sie alle Dateinamen in der Sequenz. Wählen Sie in der Menüleiste Aktionen, Sequenz ausführen aus. Öffnen Sie MZmine und importieren Sie die zuvor erhaltenen Rohausgabedateien.
Wählen Sie in der Menüleiste Rohdatenmethoden, Rohdatenimport und dann die Dateien aus, die den Beispielen entsprechen. Befolgen Sie die im Manuskript beschriebenen Schritte, um die MZmine-Analyse abzuschließen. Exportieren Sie die rohen Peak-Bereiche am Ende der MZmine-Analyse als CSV-Datei.
Öffnen Sie eine Tabelle, um die Massen von 13C-markierten Metaboliten aus dem Glukosestoffwechsel für die gezielte Suche zu berechnen. Verwenden Sie berechnete Massen von 13C-markierten Metaboliten, um Masse-zu-Ladung-Merkmale aus MZmine-Ergebnissen zu suchen und zu kommentieren. Überprüfen Sie manuell die Spektren der mutmaßlichen Anmerkungen in einem Qualitätsbrowser, um die Anmerkungen zu bestätigen.
Öffnen Sie Roadmap, Qual Browser. Öffnen Sie in der Symbolleiste die Rohdatei, um MS-Rohdaten jedes Beispiels zu importieren. Zeichnen Sie eine Linie unter den gewünschten Bereich der Retentionszeiten, die der mutmaßlichen Anmerkung auf dem Gesamtionenchromatogramm entspricht, um ein Massenspektrum anzuzeigen.
In HPLC-RID-Experimenten wurde Glukose innerhalb der ersten drei Stunden nach der Reaktion verbraucht und hauptsächlich zu Laktat fermentiert. Die Ethanolakkumulation trat auch signifikant innerhalb der ersten drei Stunden der Reaktion auf und stoppte danach. Acetat war in den Reaktionen zunächst als Bestandteil des S30-Puffers vorhanden und sammelte sich aufgrund des Stoffwechsels erst nach sechs Stunden an, als sich der Glukosekonsum verlangsamt hatte.
Laktat und Ethanol können daher als die wichtigsten Fermentationsendprodukte im lysatbasierten, zellfreien Glukosestoffwechsel angesehen werden. Es wurde beobachtet, dass sowohl Formiat als auch Succinat als kleinere Fermentationsprodukte synthetisiert wurden. Glucose-13C6 wurde durch Glykolyse beobachtbar verbraucht, wie die Schwankungen der glykolytischen Zwischenprodukte zeigen.
In Übereinstimmung mit den HPLC-Brechungsindex-Nachweisdaten akkumulierte sich Glukose zu Laktat-13C3 und wurde innerhalb der ersten drei Stunden nach der Reaktion auch zu Succinat-13C3 fermentiert. Die Aufnahme von Glucose-13C6-abgeleiteten Kohlenstoffen in die Zuckerphosphate 6-Phosphogluconolacton, 6-Phosphogluconat, Ribulose-5-phosphat und Sedoheptulose-7-phosphat wurde ebenfalls beobachtet, was die Beteiligung des Pentosephosphatwegs am Lysatglukosestoffwechsel bestätigt. Es wurde festgestellt, dass der Lysatglukosestoffwechsel die Tyrosin-13C9-Synthese nährt und gleichzeitig einen Vorläufer für die Histidin-13C5-Produktion bietet.
Wichtig ist, dass die Kontrollproben die Zeit Null genau darstellen. Stellen Sie daher sicher, dass die Proteine im Lysat vor dem Mischen in die Lösung, die Die Energiequellen enthält, inaktiviert werden. Stellen Sie außerdem sicher, dass die automatische Integration von Peaks aus Testproben, Kontrollproben und Standards konsistent ist, so dass extrahierte Peak-Bereiche vergleichbar sind.
