Neutrophile sind endständig differenzierte Zellen, und derzeit gibt es keine Zelllinien, um die Neutrophilenbiologie vollständig zu rekapitulieren. Daher ist es notwendig, reine, inaktivierte, gesunde und frische Neutrophile zu erhalten, um ihre Biologie zu studieren. Diese Refresh-Methode kombiniert Dichtegradient, Sedimentation, schonende Lyse, um eine reine neutrophile Zubereitung zu erhalten.
Es ist einfach einzurichten, erfordert einfache Ausrüstung und wenig Übung. Der technische Aspekt, wie das Gradient Layering, dieser Methode erfordert etwas Übung, aber sobald der Gradient perfektioniert ist, sollten die anderen Schritte ein Kinderspiel sein. Beginnen Sie mit der Sterilisation des Buffy-Mantels, der Verpackung und der laminaren Kapuze.
Dann fügen Sie 10 Milliliter des Blutes in ein 50 Milliliter Röhrchen hinzu. Um das Blut für einen Gradientenreiniger zu verdünnen, fügen Sie 5% FBS / HBSS hinzu und machen Sie das Volumen auf 35 Milliliter auf. Nachdem Sie den Deckel geschlossen haben, drehen Sie das Röhrchen mehrmals zum Mischen um und halten Sie das Röhrchen dann auf dem Kopf, um den Boden frei von roten Blutkörperchen zu erhalten.
Fügen Sie 10 Milliliter des Dichtegradientenmediums direkt unter dem Blut hinzu, um sicherzustellen, dass sich das Medium und das Blut nicht vermischen und die Grenzfläche scharf bleibt. Drehen Sie das Rohr 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 400 g und achten Sie darauf, die Bremse zu deaktivieren. Beobachten Sie nach dem Spinnen den Gradienten, der in eine obere Serumplasmaschicht, einen mittleren weißen Ring aus peripheren mononukleären Blutzellen, eine trübe Dichtegradientenmittelschicht und ein unteres Pellet aus einem weißen, dünnen Neutrophilenband auf den roten Blutkörperchen unterteilt ist.
Um PBMC zu entfernen, lassen Sie die Saugpipette direkt in die PBMC-Schicht austreten und vollständig absaugen, während die Serumplasmaschicht beim Entfernen des Rings abgenommen wird. Kratzen Sie die Seite des Rohres mit der Saugpipette ab, um die Entfernung des PBMC zu maximieren. Entfernen Sie vorsichtig die trübe Mittlere Schicht des Dichtegradienten zwischen dem PBMC-Ring und dem Neutrophilen-/RBC-Pellet.
Verwenden Sie für die Erythrozytensedimentation eine 10-Milliliter-Pipette, um das Neutrophilen-/ERYTHRC-Pellet in ein sauberes Röhrchen zu überführen. Dann fügen Sie 5% FBS/HBSS zu einem Endvolumen von 25 Millilitern hinzu. 25 Milliliter der vorgewärmten Lösung, die 3%Dextran/0,9%NaCl enthält, werden direkt in das Röhrchen gegeben und durch Inversion vorsichtig vermischt.
Legen Sie das Rohr für 15 Minuten auf eine nivellierte und nicht vibrierende Oberfläche. Nachdem Sie das Röhrchen wieder in die Haube gelegt haben, tauchen Sie die Pipette leicht in die Flüssigkeit ein und sammeln Sie etwa 30 Milliliter der obersten Schicht auf, die der Flüssigkeitsoberfläche nach unten folgt. Drehen Sie das Röhrchen, um ein rotes Pellet ohne schwimmende Partikel im Medium zu erhalten.
Zur Lyse des verbleibenden Erythrozyten den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie 25 Millimeter steriles Reinstwasser direkt in das Röhrchen hinzu und mischen Sie es vorsichtig, indem Sie das Röhrchen 28 Sekunden lang umkehren, um das RBC zu lysieren. Dann sofort 25 Milliliter sterile 1,8% NaCl-Lösung, die in Wasser zubereitet wurde, in das Röhrchen geben und die Lösung durch sanftes Mischen wieder in isotonische Bedingungen bringen.
Drehen Sie das Rohr bei 200 mal g für drei bis fünf Minuten mit einer niedrigen Bremse, um die Sedimentation von RBC und Blutplättchen mit Neutrophilen zu minimieren. Um das weiße Neutrophilenpellet wiederzuverwenden, fügen Sie das Kulturmedium direkt auf das Pellet auf, aber nicht auf und ab pipettieren. Als nächstes schaukeln Sie die Röhre horizontal von einer Seite zur anderen, um die Zellaktivierung zu minimieren.
Wenn eine Zellaggregation oder -verklumpung beobachtet wird, filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Netz, um die verklumpten Neutrophilen zu verwerfen. Um die Qualität des isolierten Neutrophilenpräparats zu beurteilen, färben Sie die Zellen mit Markern, die für Neutrophile, Eosinophile und einen Aktivierungsmarker spezifisch sind. Nach dem Erwerb von 20.000 Zellen mittels Durchflusszytometrie analysieren Sie die Zellreinheit und -aktivierung unter Verwendung der Gating-Strategien und bestimmen die Zelllebensfähigkeit mit Annexin V/Propidiumiodid, wie im Textmanuskript beschrieben.
Der Dichtegradient mit einer niedrigen Geschwindigkeit ergab Neutrophile mit mehr Reinheit, während eine hohe Geschwindigkeit zu einer erhöhten Ausbeute auf Kosten der Reinheit führte. Unter Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung lieferte allein die Zellverteilung eine Schätzung der Zellisolationsqualität, wobei die Verwendung spezifischer Zellmarker bevorzugt werden sollte. Die identifizierten kontaminierenden Zellpopulationen waren Monozyten, Lymphozyten und Eosinophile.
Die enorme Neutrophilenausbeute wurde mit diesem Protokoll erreicht. Die Expression von CD62L wurde beurteilt. Die mittlere Fluoreszenzintensität für CD62L war in den Positivkontrollzellen erniedrigt, was auf CD62L-Ausscheidung und Neutrophilenaktivierung hinweist.
Die Gesundheit der Neutrophilen sollte vor der Durchführung des Assays beurteilt werden, da die Neutrophilen eine relativ kurze Halbwertszeit haben und die Aktivierung die Lebensdauer weiter verkürzt. Nach der Neutrophilenreinigung unter Verwendung des Dichtegradienten und kommerzieller Mikrokügelchen wurden die Zellen 24 Stunden lang kultiviert und das Zellüberleben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Quantifizierung lebensfähiger Zellen zeigte, dass die Dichtegradientenreinigung nach 24 Stunden zu lebensfähigeren Zellen führte als die Aufreinigung mit einem Kit.
Es ist wichtig, dass die Gradientenschichtungs- und Zentrifugationsschritte so gut wie möglich durchgeführt werden, da dies die Qualität der Zubereitung stark beeinträchtigt. In-vitro-Experimente und biochemische Assays können nach diesem Verfahren durchgeführt werden. Auch könnte eine negative Selektion durchgeführt werden, wenn hochreine Zellen benötigt werden, wie in Zytokin- und Proteinexpressionsexperimenten.
