ترتبط الضامة المرتبطة بالورم المضاد للالتهابات بالتقدم وسوء التكهن في السرطان. هذا البروتوكول هو دليل لتمييز واستقطاب THP-1 الخلايا الأحادية مثل في الضامة M2 مثل في غضون 14 يوما. حاليا لا يوجد نموذج راسخ للاستقطاب THP-1 المضاد للالتهابات.
يستخدم هذا البروتوكول فترات الراحة الكافية وعملية استقطاب مطولة لإنشاء نوع فرعي ماكروفيج مميز يشبه M2. تطوير الورم ، على سبيل المثال ، في سرطان القولون وإعادة عرض الأنسجة ، يتم التحكم فيه عن طريق الضامة المضادة للالتهابات. ومن بين الدراسات التي تحقق في وظيفتها، يضمن الإنشاء الموحد لنوع فرعي متميز يشبه M2 النتائج القابلة للاستنساخ.
ابدأ بتعيين مؤقت لمدة 150 ثانية. إزالة القارورة المجمدة التي تحتوي على خط الخلية THP-1 من النيتروجين السائل وتذوب القارورة على الفور في 37 درجة مئوية في حمام مياه نظيفة، بدءا من جهاز ضبط الوقت بمجرد وضع القارورة في حمام الماء. تخفيف الغطاء لإطلاق الضغط الذي تراكم بسبب عملية الذوبان ، وضمان عدم اتصال فتحة الأنبوب بالماء لتجنب التلوث.
إذابة تعليق الخلية حتى يتم ترك رقاقة الجليد حوالي أربعة ملليمترات في الحجم داخل القارورة والمضي قدما إلى الخطوة التالية على الفور. نقل المرحلة السائلة من تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على تسعة ملليلتر من وسائل الإعلام النمو الدافئ. ثم نقل ملليلتر واحد من هذا التعليق الحار للخلايا المتوسطة في قارورة THP-1 والعودة إلى أنبوب 15 ملليلتر لإذابة رقاقة الثلج المتبقية، وتدفق القارورة لضمان عدم ترك أي خلايا وراءها.
خلط تعليق بلطف عن طريق ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة ملليلتر واحد. إزالة ما يقرب من 10 ميكرولتر من العينة لحساب الخلايا لقابلية البقاء باستخدام الأزرق تريبان. الخلايا مع السيتوبلازم واضحة قابلة للحياة، والسيتوبلازم الأزرق يشير إلى موت الخلية.
أثناء العد، قم بتدليس تعليق الخلية الدافئة بمعدل 200 مرة G لمدة سبع دقائق عند 37 درجة مئوية. إزالة supernatant تماما وإعادة إنفاق الخلايا في المتوسط النمو لتحقيق كثافة الخلية من 500،000 خلية لكل ملليلتر. اخلط التعليق برفق ونقل 22 ملليلتر إلى قوارير ثقافة الخلية T75 لكل منها.
تخزين قوارير تستقيم في حاضنة في 37 درجة مئوية مع تركيز ثاني أكسيد الكربون 5٪وتبادل وسائل الإعلام النمو كل ثلاثة إلى أربعة أيام. إعداد تعليق الخلية لزرع الخلايا بكثافة 300، 000 لكل ملليلتر لكل بئر في لوحات ثقافة الخلايا 24 جيدا. مزيج متوسط بلطف وإعداد aliquots من 26 ملليلتر في أنابيب 50 ملليلتر.
نقل ملليلتر واحد من الوسط المحتوي على الخلية إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. اخلط الوسائط برفق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا بين التحويلات. الحفاظ على حل العمل الطازجة من PMA على الجليد وإضافة 100 نانوغرام من PMA لكل بئر.
احتضان الأطباق في الحاضنة دون أي علاج آخر لمدة 72 ساعة. بعد 72 ساعة، قم بإزالة وسيط النمو واستبدله بميليلتر واحد من متوسط النمو الطازج، مع ضمان عدم لمس الجزء السفلي من الآبار بنصائح ماصة. دع الخلايا ترتاح لمدة 96 ساعة أخرى في الحاضنة.
إزالة متوسط النمو واستبداله مع ملليلتر واحد من متوسط النمو الطازج. إضافة 20 نانوغرام من إنترلوكين 4 و 20 نانوغرام من إنترلوكين 13 لكل بئر. ثم دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة في الحاضنة.
كرر العملية بأكملها بعد 48 ساعة والسماح للخلايا بالراحة لمدة 48 ساعة أخرى في الحاضنة. إزالة متوسط النمو واستبداله مع ملليلتر واحد من متوسط النمو الطازج. ثم دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة في الحاضنة.
إزالة المتوسطة الخلية الدافئة من كل بئر واستبداله مع خليط ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم و 5٪ FBS. ثم ضع لوحة الخلية على الجليد على الفور لمدة 45 دقيقة. بعد 45 دقيقة على الجليد، كشط قبالة الخلايا باستخدام كاشطات الخلايا الصغيرة.
نقل بلطف الضامة منفصلة إلى برنامج تلفزيوني الباردة و 5٪ FBS في أنبوب 15 ملليلتر أبقى على الجليد. تظهر الضامة المشتقة من أسلوب الاستقطاب التعبير عن CD14، وكذلك علامات CD11b. تم التعبير عن علامات monocyte و macrophage CD14 و CD11b في 70.9٪ و 74.7٪ من الخلايا، على التوالي.
وأظهرت الخلايا مستويات سطحية منخفضة من CD80 علامة M1 مثل في 0.2٪ من الخلايا، ومستويات سطح عالية من CD206 علامة تشبه M2 في 62.6٪ من الخلايا. كما THP-1 الخلايا في المتوسط تميل إلى الغرق إلى الجزء السفلي من قارورة وسهلة التنشيط من خلال الإجهاد الميكانيكي، خلط لطيف والتعامل مع الخلايا مهم. يتم إنشاء الضامة M2 مثل بشكل مستنسخ، وقد تم وصفها باستخدام QR-TPCR، ELISA، وتدفق قياس الخلايا.
هذا هو الأساس للتحقيق في الآليات المضادة للالتهابات في تطور السرطان أو إعادة عرض الأنسجة.
