Polysaccharide sind schlecht immunogen, es sei denn, sie sind mit Proteinen verbunden und müssen für die Derivatisierung oder Konjugation mit Proteinen aktiviert werden. Bei dieser Methode wird CDAP als Sandpfannenreagenz verwendet. Das CDAP aktiviert Polysaccharidhydroxyle zur Derivatisierung oder zur Verknüpfung mit Proteinen für die Verwendung in Impfstoffen oder diagnostischen Reagenzien.
CDAP hat Cyanogenbromid als Polysaccharid-Sand-Lading-Reagenz weitgehend ersetzt. CDAP ist einfacher zu verwenden, effizienter und kann bei einem niedrigeren pH-Wert als Cyanogenbromid verwendet werden. Es ist ein viel besseres aktivierendes Reagenz.
CDAP kann mit den meisten Polysacchariden verwendet werden, im Gegensatz zu einer reduktiven Aminierung, die vicinale Hydroxyle erfordert. Die Chemie kann sowohl direkt als auch indirekt mit Proteinen konjugiert werden, und sie kann verwendet werden, um diagnostische Reagenzien herzustellen. Die CDAP-Aktivierungsreaktion, wie ursprünglich beschrieben, war sehr schnell und schwer zu kontrollieren.
Das hier bereitgestellte Protokoll macht die Chemie viel einfacher durchzuführen und viel reproduzierbarer. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, stellen Sie den pH-Wert der Polysaccharidlösung auf 9 ein, indem Sie unter Rühren 200 Mikroliter Dimethylaminopyridin-Stammlösung tropfenweise hinzufügen. Halten Sie die Reaktion während des gesamten Aktivierungsprozesses in einem Eiswasserbad gekühlt.
Fahren Sie mit der Cyano-Dimethylaminopyridin-Tetrafluoroborat- oder CDAP-Aktivierung fort, indem Sie unter Rühren 100 Mikroliter CDAP in die Polysaccharidlösung überführen. Starten Sie den Timer und überwachen Sie die pH-Änderung während der gesamten Aktivierung für 15 Minuten. Halten Sie die Reaktion auf dem Ziel-pH-Wert, indem Sie umgehend 10 Mikroliterschritte von 0,1 molarem Natriumhydroxid hinzufügen.
Wenn die optimale Aktivierungszeit erreicht ist, fügen Sie dem aktivierten Polysaccharid zwei Milliliter 0,5 molares adipinisches Dihydrazid auf einmal hinzu. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert im erforderlichen Bereich für die Hydroxidfunktionalisierung liegt. Nach kontinuierlichem Rühren des Reaktionsgemisches für mindestens eine Stunde wird das Reaktionsgemisch auf vier Grad Celsius übertragen.
Um die ADH-Konzentration aus dem Produkt zu reduzieren, dialysieren Sie die rohe derivatisierte Polysaccharidlösung mit dem Dialysegerät. Gewinnen Sie das derivatisierte Polysaccharid aus der Dialyse zurück und bestimmen Sie die Konzentration der Polysaccharide und Hydrazide, um das Verhältnis von Hydrazid zu Polysaccharid zu berechnen. Bereiten Sie ein Milligramm pro Milliliter unmodifizierte Polysaccharidlösung vor, die als Standard verwendet werden soll.
Den Heizblock mindestens eine Stunde auf 140 Grad Celsius vorheizen, um eine stabile gleichmäßige Temperatur zu erreichen. Verwenden Sie ein Schutzpad unter und um den Heizblock herum, falls Säure verschüttet wird. Fügen Sie den markierten 13 x 100 Borosilikat-Reagenzgläsern in Triplikaten unterschiedliche Mengen von einem Milligramm pro Milliliter Kohlenhydratstandard hinzu und machen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 Mikroliter, um die gewünschten Standardkonzentrationen zu erreichen.
In ähnlicher Weise richten Sie Probenassays ein, indem Sie ein Volumen mit fünf Mikrogramm des derivatisierten Polysaccharids in drei Probenröhrchen geben. Fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete sechs Milligramm pro Milliliter Resorcin zu jedem Röhrchen hinzu. Fügen Sie mit einem wiederholten Pipetter 300 Mikroliter der vorbereiteten 75% Schwefelsäure zu jedem Rohr hinzu, wirbeln Sie die Rohre kräftig ein, richten Sie das Rohr weg, legen Sie dann alle Rohre in einem gleichmäßigen Tempo in sequenzieller Reihenfolge in einen Heizblock und stellen Sie den Timer sofort für drei Minuten ein.
Nach drei Minuten die Schläuche in der gleichen Reihenfolge entfernen und direkt in ein Gestell in einem Eiswasserbad legen. Entfernen Sie die eiskalten Röhren, damit sie sich fünf Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen können. Lesen Sie die Absorption aller Röhrchen auf einem UV-Vis-Spektralphotometer bei 430 Nanometern mit einer 10-Millimeter-Pfadlängenküvette.
Um Assay-Reaktionen einzurichten, sortieren und ordnen Sie die markierten Standardröhrchen im Röhrchengestell in der Reihenfolge der zunehmenden Konzentration an. Fügen Sie mit einer kalibrierten Mikropipette 100 Mikroliter der Standards zu jedem entsprechenden Rohr hinzu. Verwenden Sie für den Nullstandard 100 Mikroliter des Probenpuffers.
Bereiten Sie die Probenröhrchen ebenfalls vor und ordnen Sie sie an. Dann mit einer kalibrierten 1.000 Mikroliter Mikropipette 875 Mikroliter Assay-Puffer zu allen Assay-Röhrchen hinzufügen. Um die Assay-Reaktion zu starten, fügen Sie innerhalb von fünf Minuten 25 Mikroliter 1% Trinitrobenzolsulfonsäure in jedem Assay-Röhrchen in der vorgegebenen Reihenfolge hinzu.
Wirbeln Sie die Assay-Röhrchen für zwei Sekunden mit hoher Geschwindigkeit vor und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit bis zu einer Höhe von einem halben Zoll von der Rohröffnung wirbelt. Notieren Sie die Startzeit des Assays und stellen Sie den Timer auf zwei Stunden ein. Dann stellen Sie das Assay-Tube-Rack für zwei Stunden bei Raumtemperatur in die Dunkelheit.
Wenn die Zeit vorbei ist, wirbeln Sie die Rohre und fahren Sie mit der Datenerfassung fort. Das ADH-Dextran wurde mit dem Resorcin-Schwefelsäure-Assay auf Dextran untersucht. Ein typisches Standardröhrchen mit Glukose als Zuckerstandard wurde gezeichnet.
Der Hydrazidgehalt in derivatisiertem Polysaccharid oder Dextran wurde mit dem TNBS-Assay bestimmt. Der Grad der Derivatisierung wurde als Hydride pro 100 Kilodalton Dextran berechnet, um den Vergleich zwischen Polymeren unterschiedlicher mittlerer Molekulargewichte zu erleichtern. Das hier beschriebene Protokoll muss möglicherweise für ein bestimmtes Polysaccharid angepasst werden.
CdAP-Chemie kann verwendet werden, um Polysaccharide für die Verwendung mit einer Vielzahl von Konjugationsreagenzien zu funktionalisieren. Es kann beispielsweise verwendet werden, um Polysaccharide für den Einsatz in ELISAs zu biotinylatieren. Proteine können direkt mit CDAP-aktivierten Polysacchariden in Verbindung gebracht werden, dies erfordert jedoch in der Regel eine gewisse Optimierung für ein bestimmtes Polysaccharid.
Die Konjugationsausbeute kann über 75% betragen Die Verwendung der CDAP-Chemie hat kostengünstige Konjugiertimpfstoffe ermöglicht, wie sie beispielsweise vom Serum Institute of India hergestellt wurden.
