Dieses Protokoll ermöglicht eine In-vitro-Bewertung der Auswirkungen von Einschluss und mittlerer Steifigkeit, denen native Megakaryozyten im Knochenmark ausgesetzt sind, auf ihr Verhalten und ihre Reifung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ein vereinfachtes Modell, das Zell-Zell- und Zellmatrix-Interaktionen eliminiert und sich auf die mechanischen Aspekte konzentriert. Gute Laborpraxis und sterile Arbeitsbedingungen sind strikt einzuhalten.
Tatsächlich kann selbst eine leichte Kontamination des Hydrogels einen dramatischen Einfluss auf die Differenzierung der Megakaryozyten haben. Um eine einzelne Vertiefung der Hydrogel-Zellkultur zu erhalten, beginnen Sie mit dem Auftauen von zwei Ein-Milliliter-Aliquoten von 3% Methylcellulose bei Raumtemperatur, dann beschichten Sie eine Ein-Milliliter-Luer-Lock-Spritze mit der Methylcellulose, indem Sie zuerst einen Milliliter ziehen und dann alles ausstoßen. Als nächstes ziehen Sie mit derselben Spritze und Nadel 333 Mikroliter Methylcellulose aus einem frischen Aliquot.
Nachdem Sie die Nadel vorsichtig entfernt haben, schrauben Sie mit einer sterilisierten Pinzette einen Luer-Lock-Anschluss an das Ende der Spritze und befestigen Sie dann eine zweite unbeschichtete Luer-Lock-Spritze mit einem Milliliter am Stecker. Verteilen Sie die Methylcellulose gleichmäßig auf die beiden Spritzen und legen Sie sie beiseite. Als nächstes resuspendieren sie die zuvor isolierten negativen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen der Mauslinie im konzentrierten Kulturmedium mit einer Dichte von einmal 10 zu den sechs Zellen pro 167 Mikroliter.
Trennen Sie eine der Spritzen vom Stecker und pipettieren Sie 167 Mikroliter der Zellsuspension direkt in den Verbinder, während Sie gleichzeitig den Spritzenkolben langsam ziehen, um Platz für die Zellsuspension zu schaffen. Nachdem Sie die gesamte Zellsuspension in den Verbinder gegeben haben, ziehen Sie den Kolben weiter, um die Aufhängung vom Stecker zu ziehen, und schließen Sie die zweite Spritze vorsichtig wieder an, wobei Sie darauf achten, dass keine Aufhängung im Schraubgewinde verloren geht. Um das Methylcellulosemedium mit der Zellsuspension zu homogenisieren, bewegen Sie die Kolben langsam 10 Mal zwischen den beiden Spritzen hin und her, ziehen Sie dann das Gesamtvolumen in eine Spritze und trennen Sie die beiden Spritzen, wobei Sie den Stecker auf der leeren belassen.
Leeren Sie den Inhalt der Spritze in eine Vertiefung einer Vier-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad unter 5% Kohlendioxid. Um Proplatelets zu analysieren, werden am dritten Tag der Kultur alle Zellen vorsichtig von einer Vertiefung in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Milliliter DMEM mit 1% PSG übertragen. Resuspendieren Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren, um die Methylcellulose vollständig zu verdünnen, und zentrifugieren Sie dann das Röhrchen fünf Minuten lang bei 300 mal G bei Raumtemperatur.
Nach dem Verwerfen des Überstandes wird das Zellpellet in einem Milliliter des vollständigen Kulturmediums resuspendiert und die Zellen mit 500 Mikrolitern pro Vertiefung einer Vier-Well-Platte erneut ausgesät. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag erfassen Sie mit einem Hellfeldmikroskop mit einem 20-fachen Objektiv nach dem Zufallsprinzip 10 Bilder pro Vertiefung, um sicherzustellen, dass nicht zu viele Zellen im Sichtfeld vorhanden sind und mindestens fünf Megakaryozyten pro Feld erfasst werden.
Zählen Sie mit ImageJ die Gesamtzahl der Megakaryozyten und der sich verlängernden Proplatelets in jedem Bild, um den Anteil der Megakaryozyten zu berechnen, die Proplatelets verlängern. Um die Zellen für zukünftige Analysen zu fixieren, fügen Sie die fixierende Lösung auf die Methylcellulose auf, ohne das Gel zu stören. Nachdem Sie je nach verwendetem Fixiermittel eine angemessene Zeit abgewartet haben, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um das Fixiermittel und das Gel vorsichtig zu pipettieren, bis die Methylcellulose homogen verdünnt ist.
Und mit der gleichen Pipettenspitze den gesamten Inhalt der Vertiefung in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Milliliter DPBS geben und durch Mischen homogenisieren. Zentrifugieren Sie die Mischung. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Megakaryozytenpellet in einem für die gewünschte Analyse geeigneten Medium.
Am dritten Tag der Kultur haben sich Megakaryozyten im flüssigen Medium am Boden des Bohrlochs sedimentiert und stehen in Kontakt mit der steifen Kunststoffoberfläche sowie anderen Zellen. Im Gegensatz dazu sind Zellen, die in das Methylcellulose-Hydrogel eingebettet sind, homogen verteilt und von benachbarten Zellen isoliert. Eine Analyse des mittleren Durchmessers von Megakaryozyten unter verschiedenen Kulturbedingungen zeigt, dass 2% Methylcellulose den mittleren Megakaryozytendurchmesser im Vergleich zur Flüssigkultur leicht erhöht.
Eine Erhöhung der Methylcellulosekonzentration um 0,5% beeinträchtigt jedoch die Megakaryozytendifferenzierung, wie ein kleinerer mittlerer Durchmesser zeigt. In repräsentativen Transmissionselektronenmikroskopiebildern scheinen die intrazytoplasmatischen Membranen in Megakaryozyten, die in vivo im Knochenmark differenziert sind, eng mit abgegrenzten zytoplasmatischen Territorien kontrastiert zu sein. In flüssiger Kultur haben die Membranen meist ein kleines rundes ovales Aussehen oder längliche Vesikel ohne Abgrenzung von zytoplasmatischen Territorien.
Im Gegensatz dazu hat die 2%ige Methylcellulosekultur dicht gegenüberliegende Membranen mit abgrenzenden zytoplasmatischen Territorien, die der In-situ-Struktur ähneln. Am vierten Tag der Kultur zeigen Megakaryozyten, die zuvor in Hydrogel kultiviert wurden, eine erhöhte Proplatletbildung im Vergleich zu denen, die in flüssigem Medium kultiviert wurden. Der mittlere Anteil an Megakaryozyten-verlängernden Proplaten beträgt bei einer flüssigen Präkultur in der Regel etwa 15 bis 20% im Vergleich zu 35 bis 40% mit einer Methylcellulose-Hydrogel-Präkultur.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die entsprechenden Volumina sehr genau zu pipettieren, da eine geringfügige Änderung der endgültigen Methylcellulosekonzentration die Mediensteifigkeit erheblich verändern kann. Nach der Zellreifung im Hydrogel können Megakaryozyten für die Ploidie und Zellmarkeranalyse durch Durchflusszytometrie gewonnen oder für die Elektronenmikroskopie oder Immunfärbung des interessierenden Proteins fixiert werden.
