Hier stellen wir verbesserte Protokolle zur Herstellung von Kryo-EM-Proben mit Trägerfolien unter Verwendung eines neuartigen Flotationsblocks vor, der die Handhabung solcher empfindlichen Filme erleichtert. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass die Probe vor der Luft-Wasser-Grenzfläche geschützt ist, wo schädliche Effekte wie Denaturierung auftreten können. Eines der hier vorgestellten Protokolle vermeidet jede Art von teurer Behandlung, um die Grafische Darstellung hydrophil zu machen, wodurch die Zugänglichkeit für die gesamte EM-Gemeinschaft erhöht wird.
Kleine Flotationsgeräte sind in der Elektromikroskopie für eine gute Vorbereitung noch nicht weit verbreitet. So können diese visuellen Demonstrationen einen Maßstab für ihre Verwendung liefern. Waschen Sie zunächst die TEM-Gitter mit doppelt destilliertem Wasser und Ethelacetat, gefolgt von einer Plasmareinigung.
Dann werden 10 bis 12 Mikroliter der Probe in die Pufferaustauschbohrung, den Flotationsblock und 10 bis 12 Mikroliter 2%ige Urinalacetatlösung in die angrenzende Pufferaustauschbohrung für negative Färbung gegeben. Es ist wichtig, bei der Arbeit mit Flecken angemessene Sicherheitsvorkehrungen zu treffen. Schneiden Sie vorsichtig zwei kleine Glimmerstücke mit voreingestelltem Kohlefilm darauf.
Stellen Sie sicher, dass die Glimmerfragmente breit genug sind, um in den Brunnen zu passen, und länger als die Bohrlochlänge, so dass das Fragment auf dem Brunnen sitzen kann, während der Kohlenstoff schwimmt und genügend Platz vorhanden ist, um das Fragment mit der Pinzette zu handhaben. Tauchen Sie den Glimmer mit einem ungefähren Winkel von 45 Grad in den Brunnen ein, bis der Glimmer auf der Rampe des Bohrlochs sitzt und die Kohlenstoffschicht an der Oberfläche der flüssigen Probe beobachtet wird. Nachdem Sie den Kohlenstoff mit der Probe inkubiert haben, ziehen Sie die Glimmerplatte sehr langsam zurück, um den Kohlenstofffilm zurückzugewinnen und die verbleibende Viscus-Probenretention zu minimieren.
Tupfen Sie den Glimmer vorsichtig ab, indem Sie mit einem Filterpapier auf die untere kohlenstofffreie Oberfläche klopfen, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und tauchen Sie das Glimmerfragment in die gegenüberliegende Vertiefung ein, die 2% Urinalacetatlösung enthält, um die Kohlenstoffschicht mit dem negativen Fleck auszutauschen. Stellen Sie die schwimmende Kohlenstoffschicht mit der heiligen kohlenstoffbedeckten Seite des gewaschenen und plasmagereinigten EM-Gitters wieder her. Lassen Sie die Gitter dann an der Luft trocknen, bis sie auf dem TEM abgebildet sind, und decken Sie sie vorzugsweise ab, um eine Kontamination durch die Luft zu vermeiden.
Nachdem Sie die TEM-Gitter wie zuvor demonstriert gereinigt haben, bereiten Sie die Graphenoxidsuspension kurz vor gebrauchsfertigen und gründlich vor. Dann fügen Sie 10 bis 12 Mikroliter Graphenoxidsuspension in die vier Nicht-Pufferaustauschtöpfe hinzu. entlang des Flotationsblocks.
Fügen Sie 10 bis 12 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser oder ultrareines Wasser in die verbleibenden vier Pufferaustauschtöpfe des Blocks hinzu. Lassen Sie vier Gitter vorsichtig auf die Graphenoxidsuspension jedes Bohrlochs fallen und inkubieren Sie eine Minute lang, um sicherzustellen, dass die mit heiligem Kohlenstoff bedeckte Seite mit der Lösung in Kontakt kommt. Nach einer Minute stellen Sie jedes Gitter vorsichtig wieder her, indem Sie die Pinzette in die Pinzettenrille jedes Nicht-Pufferaustauschschachts schieben.
Stupsen Sie vorsichtig und kurz die kupferfreie Seite jedes Gitters mit dem doppelt destillierten Wasser in den angrenzenden Brunnen, bis der Wassertropfen auf dem Gitter sichtbar ist. Halten Sie dann den Gitterwassertropfen vorsichtig kopfüber gegen ein Stück Filterpapier. Decken Sie die Gitter ab und lassen Sie sie in der Pinzette an der Luft trocknen.
Legen Sie vier Waschgitter auf eine Kupfer-Graphing-Platte, die auf einem Glasobjektträger abgeschieden ist, und bedecken Sie jedes Gitter mit einem Tropfen Isopropanol, um einen engen Kontakt zwischen dem Monolayer-Graphen und dem Gitter zu ermöglichen. Nach der vollständigen Verdampfung des Isopropanols die Kupfergraphenplatte mit Gittern auf die Eisenchloridlösung in der Glas-Petrischale schwimmen lassen. Decken Sie dann die Schüssel ab, um eine Kontamination durch die Luft zu vermeiden, und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur ätzen.
Verwenden Sie eine Schlaufe mit einem Durchmesser, der größer als die TEM-Gittergröße ist, um die auf der Graphen-Monoschicht schwimmenden Gitter herauszufischen und sie vorsichtig in eine Glas-Petrischale mit doppelt destilliertem Wasser zum Waschen zu übertragen. Waschen Sie die Gitter zweimal in Wasser und geben Sie die Gitter in eine Petrischale mit Probenpuffer, bis die Probenvorbereitung vorbereitet und eingefroren wird. 10 bis 12 Mikroliter der Probe in eine Vertiefung des Flotationsblocks geben.
Wenn die Probe im Block fertig ist, nehmen Sie das mit Graphen beschichtete Gitter aus der Pufferlösung mit einer sauberen Pinzette und legen Sie es auf die Oberfläche der Probe, die well enthält. Nehmen Sie nach einer angemessenen Inkubationszeit das Gitter mit einer sauberen Gefrierpinzette auf und fahren Sie mit dem Blottieren und Verglasen fort. Negativ gefärbte Gitter, die mit dem Stützflotationsblock hergestellt wurden, sind typischerweise mit amorphem Kohlenstoff über die gesamte Gitteroberfläche bedeckt.
Während in einigen Fällen ein Bruch des Kohlenstofffilms auftritt, ist eine große Anzahl von Gitterquadraten makellos und daher für negative Färbezwecke geeignet. In ähnlicher Weise wird eine gute Filmabdeckung routinemäßig über das gesamte Gitter mit dem Graphenoxid-Protokoll erreicht. Graphenoxidgitter können schnell aus Rohstoffen hergestellt werden und schützen die Probe in hohem Maße.
Es reicht aus, das Graphen kurz vor dem Einfrieren nass zu halten und die Probenapplikation in situ zu halten, um geeignete Eisschichten für Kryo-EM zu erzeugen. Dieses Protokoll erfordert keine Ausrüstung, um das Graphen hydrophil zu machen, und bietet einen Vorteil für die Probenrückgewinnung. Der Stützflotationsblock verfügt über zwei Nadelöffnungen an der Stelle jedes Bohrlochs, die eine Pufferausdehnung in C2 ermöglichen, was für Proben aus Glykolgradienten sehr nützlich ist.
Der Flotationsblock hat die Erforschung von On-Grid-Affinitätsreinigungsmethoden ermöglicht, indem er einen kontrollierbaren Pufferfluss kleiner Volumina sowie funktionalisierte Stützfolien verwendet.
