Der endotheliale zu mesenchymale Übergang ist ein zellulärer Prozess, bei dem Endothelzellen ihre Kopfsteinpflastermorphologie in einen fibroblastenartigen Phänotyp verwandeln. Und das Zytokin TGF-beta, transformierender Wachstumsfaktor beta, ist ein Haupttreiber dieses Übergangs. Die Analyse der Veränderungen in der Zellmorphologie und der Expressionsniveaus von endothelialen und mesenchymalen Markern ermöglicht es uns, das Auftreten eines endothelialen zu mesenchymalen Übergangs zu beurteilen.
Neue Daten verbinden den endothelialen zu mesenchymalen Übergangsprozess mit verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Fibrose. Und die Daten deuten darauf hin, dass die Intervention von therapeutischem Nutzen sein kann. Durch die Stimulierung des endothelialen zu mesenchymalen Übergangsprozesses, der während der Embryogenese und Organentwicklung auftritt, können wir möglicherweise mesenchymale Gewebe wie Knorpel, Knochen und Muskeln regenerieren.
Um das intrazelluläre Protein durch Immunfloureszenzfärbung nachzuweisen, ist eine Zellpermeabilisierung mit 0,1% Triton X-100 notwendig, damit die Antikörper die Zellmembranen passieren können. Mit dieser Videodemonstration werden die Forscher ein gutes Verständnis dafür bekommen, wie sie die Rolle von Zytokinen wie TGF-beta beim endothelialen zu mesenchymalen Übergang untersuchen können. Zuerst 1 x 10 ^5 spiegelnde Pankreasinsel-endotheliale MS1-Zellen in DMEM mit 10% FBS und 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und Streptomycin auf einer 0,1% gelatinebeschichteten Kulturplatte.
Nach der Inkubation über Nacht im Zellkulturinkubator waschen Sie die Zellen mit PBS, bevor Sie mit zwei Millilitern 0,25% Trypsin, 0,02% EDTA-Lösung für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius behandelt werden. Wenn sich die Zellen zu lösen begonnen haben, löschen Sie die Reaktion mit fünf Millilitern des vollständigen Kulturmediums ab und übertragen Sie die resultierende Zellsuspension zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Das Pellet wird zum Zählen in vier Milliliter frischem, vollständigem Medium resuspendiert.
Und 1 x 10^3 Zellen pro Kubikzentimeter in einen neuen Zellkulturbehälter einsäen. Nach der Kultur über Nacht werden zwei Vertiefungen mit fünf mikromolaren TGF-beta-Rezeptorkinase-Inhibitoren SB-431542 und zwei Vertiefungen mit DMSO-Lösungsmittelkontrolle behandelt. Und legen Sie die Zellen für 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator.
Am Ende der Inkubation behandeln Sie zwei Vertiefungen mit Fahrzeugsteuerung und zwei Vertiefungen mit TGF-beta 2. Verwenden Sie nach drei Tagen ein invertiertes Mikroskop, um die Zellmorphologie jeder Zellbehandlungsgruppe unter Hellfeldbildgebung zu untersuchen. Um endMT-bedingte Markerveränderungen durch immunfluoreszierende Färbung zu beurteilen, lösen Sie die Zellen von einer geeigneten MS1-Zellkultur, wie gezeigt.
Und säen Sie die Zellen mit einer Konzentration von 1,9 x 10 ^ 3 Zellen auf 0,1% gelatinebeschichteten 12 Millimeter runden Deckgläsern, die in einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte platziert sind. Nach der Nachtkultur behandeln Sie die Zellen drei Tage lang mit einem Nanogramm Milliliter TGF-beta 2. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren die behandelten Kulturen mit 300 Mikrolitern 4% Formaldehyd pro Vertiefung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Am Ende der Fixierung waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, bevor Sie die Zellen mit 300 Mikrolitern von 0,1% Triton X-100 und PBS pro Vertiefung für 10 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisieren. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal in PBS und blockieren die Zellen mit 3% BSA in PBS. Nach 45 Minuten bei Raumtemperatur die Zellen mit primären PECAM-1- und SM22-alpha-Antikörpern für 45 Minuten bei Raumtemperatur beschriften, gefolgt von drei Wäschen in PBS.
Nach der letzten Wäsche die Zellen mit den entsprechenden sekundären Antikörpern für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und die Zellen dreimal mit PBS waschen, bevor Sie die Zellen mit einem DAPI-ergänzten Montagemedium und einem Abdeckschein montieren. Versiegeln Sie dann die Kanten des Deckzettels mit klarem Nagellack und bilden Sie die Zellmarkerexpression durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit den entsprechenden Filtern nach Standard-Bildgebungsprotokollen. Nach dreitägiger Behandlung mit TGF-beta 2 verlieren endotheliale MS1-Zellen ihre kopfsteinpflasterartige Struktur und differenzieren sich zu spindelförmigen mesenchymalen Zellen.
Diese TGF-beta 2-induzierte Differenzierung wird unterdrückt, wenn die Zellen dem TGF-beta-Rezeptorkinase-Inhibitor SB-431542 ausgesetzt werden. Die Expression des endothelialen Proteins PECAM-1 ist nach TGF-beta-2-Stimulation stark verringert, während der mesenchymale Faktor SM-22 alpha stark hochreguliert ist. Darüber hinaus wird Snail durch TGF-beta 2-Exposition deutlich hochreguliert, während die Slug-Expression nicht beeinflusst wird.
Wie beobachtet, kann die CRISPR-Cas9-Genbearbeitung verwendet werden, um die Einführung von zwei unabhängigen Schnecken-Einzelleiter-RNAs in Cas9-exprimierende MS1-Zellen zu erleichtern, um die Schneckenexpression zu stören. Der Knockout von Snail reicht aus, um die fibroblastenähnliche Zellmorphologie, die durch TGF-beta 2 in MS1-Zellen angetrieben wird, zu hemmen und den TGF-beta 2-vermittelten PECAM-1-Rückgang und die SM-22-alpha-Verbesserung zu blockieren. Die Beurteilung von Veränderungen in der Zellmorphologie und Expression endothelialer und mesenchymaler Marker durch Immunfluoreszenz kann durch Messung der Expression dieser Marker auf quantitativer PCR in der Western-Blot-Analyse weiter validiert werden.
Diese Technik zum Nachweis des endothelialen zu mesenchymalen Übergangs hat es den Forschern ermöglicht, diese aufkommende Bedeutung als physiologischen Prozess zu untersuchen, der bei mehreren Krankheiten auftritt.
