Die Organogenese-Stadien in den Mausembryonen sind nach wie vor schlecht untersucht, was zum Teil auf die schwierige Visualisierung der komplexen Strukturen des Embryos zurückzuführen ist. Dieses Protokoll beschreibt Techniken, die eine 3D- und 4D-Visualisierung und Analyse von Mausembryonen während der axialen Ausdehnung und Segmentierung ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, die komplexen Strukturen des Mausembryos als dynamische 3D-Objekte zu untersuchen und zu zeigen.
Dieses Protokoll enthält Techniken, die bei der Untersuchung angeborener Fehlbildungen verwendet werden können, die den Wirbel und das Rückenmark von Säugetieren betreffen, wie Skoliose. Diese Techniken können auch mit In-vitro-Modellsystemen verwendet werden, wodurch die Untersuchung der menschlichen Embryonalentwicklung ermöglicht wird. Um Mausembryonen zwischen dem embryonalen Tag 8,25 und dem embryonalen Tag 10,5 für die Lebendbildgebung vorzubereiten, sezieren Sie die Embryonen in vorgewärmtem M2-Medium bei 37 Grad Celsius.
Entfernen Sie den Dottersack vorsichtig mit einer sauberen Pinzette und waschen Sie den Embryo einmal mit frischem M2-Medium, um Blut und Ablagerungen zu entfernen, die während der Dissektion entstanden sind. Während des Live-Bildgebungsverfahrens brüten Embryonen in niedrigem Glukose-DMEM-Medium, ergänzt mit 10% HyClone definiertem FBS, zwei millimolaren L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin in einer 37 Grad Celsius beheizten Kammer und einem 65% Sauerstoff mit 5% Kohlendioxid-Umgebung. Um Mausembryonen im ähnlichen Stadium für die Immunfluoreszenzmikroskopie vorzubereiten, anstatt erhitztes M2 zu verwenden, sezieren Sie die Embryonen in kaltem PBS und fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd.
Nach Durchführung des gesamten Mount-Immunfluoreszenz-Färbeprotokolls, wie im Textmanuskript beschrieben, kann die Gewebereinigung mit RapiClear erreicht werden. Legen Sie zuerst die Embryonen in die Mitte eines konkaven Glasobjektträgers mit einer Vertiefung von 75 x 25 Millimetern, entfernen Sie den gesamten PBST im Mikroskop-Vertiefungsobjektträger und fügen Sie 200 Mikroliter Klärlösung hinzu, dann bedecken Sie die Objektträgervorbereitung mit einer Box. Nach 10 Minuten vor Licht geschützt, wenn die Embryonen transparent werden, ersetzen Sie die Klärlösung und warten Sie weitere 20 Minuten.
Bedecken Sie den Embryo mit einem Deckglas, das von einer Seite ausgeht und sich sanft zur anderen bewegt. Die Probe ist nun bereit für die Bildgebung. Stellen Sie für das Clearing mit Methylsalicylat oder BABB sicher, dass die Embryonen vollständig in 100% Methanol dehydriert sind, und beginnen Sie dann die Reihe von BABB und Methanol mit 20% sukzessiven Konzentrationserhöhungen und einer 20-minütigen Inkubation für jeden Schritt.
Wenn die BABB-Lösung 100% erreicht, nehmen Sie zwei zusätzliche Änderungen für eine neue Lösung vor. Bereiten Sie einen 20 x 60 Millimeter großen 1,5-Deckglas-Objektträger vor, um die Embryonen zu montieren, um eine Komprimierung der Probe zu vermeiden. Fügen Sie Abstandshalter aus dünnen Metallscheiben hinzu.
Übertragen Sie die gereinigten Embryonen mit einem Zahnstocher, einer feinen Baumwollspitze oder einer Pasteur-Pipette auf die Objektträger. Fügen Sie dann einen Tropfen Montagemedium hinzu, bedecken Sie es mit einem anderen ähnlichen Deckglas und versiegeln Sie es mit geschmolzenem Paraffin, um die Vorbereitung besser zu stabilisieren und Blasen zu vermeiden. Legen Sie das Deckglas auf eine Seite und schieben Sie es dann allmählich und vorsichtig zur Seite, wobei Sie bei Bedarf mehr Medium hinzufügen.
Die Probe ist nun bereit, im Mikroskop abgebildet zu werden. Verwenden Sie Fidschi/ImageJ, um den Embryo nach der Bildgebung in eine standardisierte vorder-posteriore und dorsal-ventrale Achsenposition zu bringen. Reduzieren Sie die Datensatzgröße im Bild von Fidschi, skalieren und fügen Sie dann die X-, Y- und Z-Skalierungswerte ein, die erforderlich sind, um das Dataset auf weniger als 200 Megabyte zu reduzieren.
Stellen Sie sicher, dass die Option Neues Fenster erstellen aktiviert ist. Gehen Sie dann zu Plugins und öffnen Sie 3D Viewer. Klicken Sie im 3D-Viewer-Fenster auf den Embryo, um ihn auszuwählen, wodurch ein rotes 3D-Feld angezeigt wird.
Wenn Sie diesen Modus verwenden, steuern Sie die Drehung des Datensatzes mit einer Maus. Nachdem Sie die perfekte Position des Embryos sichergestellt haben, wählen Sie Bearbeiten, Transformieren des Bildes und Exportieren des transformierten Bildes im 3D-Viewer-Fenster. Untersuchen Sie die verschiedenen orthogonalen Ebenen, gehen Sie dann zum Bild, stapeln Sie sie und wählen Sie orthogonale Ansichten aus.
Wenn der Embryo richtig positioniert ist, wählen Sie das 3D-Viewer-Fenstermenü und bearbeiten, transformieren und speichern Sie dann die Transformationsmatrix in einer Textdatei mit der Erweiterung mat. Öffnen Sie die Textdatei mit Fiji/ImageJ, entfernen Sie die ersten beiden Zeilen und speichern Sie sie erneut. Dadurch wird eine Transformationsmatrixdatei erstellt, die mit dem TransformJ-Plugin kompatibel ist.
Wechseln Sie zum Datensatz mit voller Auflösung und führen Sie die Operation-Plugins TransformJ und TransformJ affine aus. Suchen Sie im neuen Fenster nach der zuvor gespeicherten Matrixdatei, wählen Sie die kubische B-Spline-Interpolation aus, führen Sie ein isotropes Resampling durch, und klicken Sie dann auf OK. Nachdem Sie den Embryo richtig neu positioniert haben, schneiden Sie den größten Teil des entstandenen leeren Raums ab. Um ein vollständiges Z-Projektionsbild auszuführen, klicken Sie auf Stapel, Z-Projekt und wählen Sie die maximale Intensität.
Zeichnen Sie dann den minimalen ROI, der den gesamten Embryo in X und Y enthält.Wechseln Sie zu den Bildfenstern des ursprünglichen Datensatzes, indem Sie auf Bearbeiten, Auswahl, Auswahl wiederherstellen und Zuschneiden klicken, indem Sie das Bild auswählen. Schneiden Sie die Scheiben am Anfang und Ende zu, die sich nicht mit Embryogewebe überschneiden, indem Sie Bild- und Öffnungsstapel auswählen, auf Werkzeuge klicken, den Scheibenentferner auswählen und die erste und letzte zu entfernende Scheibe angeben, wobei Sie sicherstellen, dass das Inkrement in eins geändert wird. Führen Sie auf Wunsch weitere Analysen und 3D-Rekonstruktionen anhand der Anweisungen im Textmanuskript durch.
Um eine 3D-Analyse von weiter entwickelten Embryonen durchzuführen, sezieren Sie embryonale Föten am 18,5. Tag in kaltem PBS, entfernen Sie alle zusätzlichen embryonalen Membranen und waschen Sie die Föten mehrmals in frischem PBS, um Blut und Ablagerungen zu entfernen, die während des Dissektionsverfahrens produziert wurden. Fixieren Sie Föten in 4% PFA in PBS bei vier Grad Celsius für fünf bis sieben Tage. Nachdem Sie den Embryo mehrmals in PBS gewaschen haben, dehydrieren Sie die Föten, indem Sie in 10% 10% aufeinanderfolgenden Erhöhungen von Methanollösungen inkubieren, bis 100% Methanol erreicht ist.
Führen Sie jede Inkubation für 25 Minuten auf einem Shaker bei Raumtemperatur durch. Als nächstes brüten Sie Föten separat auf einem Shaker zuerst für einen Tag in 5% Wasserstoffperoxid in Methanol und dann in 10% Wasserstoffperoxid in Methanol für bis zu drei Tage, bis die Embryonen alle natürliche Pigmentierung verlieren. Rehydrieren Sie die Embryonen schrittweise in einer umgekehrten Methanolserie in demineralisiertem Wasser mit jeder Inkubation für 20 Minuten auf einem Shaker bei Raumtemperatur und waschen Sie die Embryonen dann dreimal für 30 Minuten pro Waschgang in demineralisiertem Wasser.
Um Föten in 1%-Agaroseblöcke einzubetten, füllen Sie ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen oder eine Spritze mit geschmolzener Agarose, legen Sie dann den Fötus in der Agarose in eine vertikale Position und halten Sie diese Position mit einer Pinzette während der Erstarrung der Agarose. Legen Sie die Form mit dem Block bei vier Grad Celsius für 30 Minuten, damit die Agarose vollständig gelalysiert wird, entfernen Sie dann den Agaroseblock mit dem Fötus aus der Form und legen Sie ihn in einen Behälter mit demoralisiertem Wasser. Führen Sie eine Dehydratisierung des Fötus allmählich mit einem Anstieg der Methanolkonzentration um 10% durch, die in demineralisiertem Wasser oder PBS verdünnt wird, und halten Sie die Probe mindestens 45 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Shaker, bis 100% Methanol erreicht ist.
Beseitigen Sie die Föten, indem Sie sie durch eine Reihe von BABB-Lösung und Methanol für 2,5 Stunden in jeder Konzentration bewegen, wobei die BABB-Konzentration um 25% zunimmt, bis 100% BABB erreicht werden. Ersetzen Sie die BABB-Lösung jeden Tag durch eine frische, bis der Fötus vollständig transparent ist. Dieser Vorgang kann drei bis fünf Tage dauern.
Verwenden Sie Klebstoff, um den gereinigten Agaroseblock an der Motorachse des OPT-Scanners zu befestigen, passen Sie dann die Optik an, um ein Bild des gesamten Fötus zu erhalten, und fahren Sie fort, einen vollständigen Projektionsdatensatz zu erfassen. Die 4D-Live-Bildgebungstechnik ermöglicht die dynamische Analyse der LuVeLu-Reporterexpression und der embryonalen Snai1-bedingten Knockout-Embryonen am Tag 8,5. Zusammen mit dem normalen LuVeLu-Signal auf dem präsomitischen Mesoderm zeigen Snai1-bedingte Knockout-Embryonen eine LuVeLu-Expression in der ektopischen Ausbuchtung, die sich aus dem primitiven Streifen ergibt.
Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Assays ermöglichen den Nachweis potenzieller NMPs und wichtiger Regulatoren der Mesoderm-Differenzierung. Weiße und gelbe Pfeile verdeutlichen Unterschiede in den mutierten und Wildtyp-Embryonen. Die 3D-Darstellung ganzer Mount-Immunfärbungen ermöglicht ein besseres Verständnis des Gewebes oder der Struktur in der Studie.
In diesem Fall wurde die Position potenzieller NMPs in der Schwanzknospe untersucht. 3D-Geweberekonstruktionen sind auch wichtig, um morphologische Defekte in Mausembryonen zu verstehen und zu charakterisieren. Die interaktive Visualisierung der 3D-Rekonstruktion kann auch in benutzerfreundlichen Formaten erstellt werden.
Zum Beispiel in einer PDF-Datei. Diese 3D-Embryo-Schwanzstrukturen können verwendet werden, um die Leistungsfähigkeit von 3D-Modellen einem allgemeineren Publikum zu veranschaulichen und bei der Untersuchung bei der Lehre einer axialen Dehnung und Segmentierung von Wirbeltieren zu helfen. Schließlich ist eine 3D-in-toto-Visualisierung von weiter entwickelten Mausembryonen mit der OTP-Mikroskopie-Technik möglich.
Hier werden animierte Renderings gezeigt, die wichtige Scheiben von Föten des embryonalen Tages 18,5 hervorheben. Das Wichtigste, woran man sich erinnern sollte, ist, dass das Ergebnis eine getreue Darstellung dessen bleiben muss, was im Embryo beobachtet wird. Forscher können diese Methoden verwenden, um über die Präsentation von nur statischer Darstellung der Bilder hinauszugehen, sondern auch Videos, dreidimensionale Rekonstruktionen und sogar interaktive 3D-Modelle ihrer Daten einzubeziehen.
