Skidmore Fakultät Entwicklungszuschuss finanziert die Erstellung und Veröffentlichung des Manuskripts.

1. Montage Embryonen (nach Abschluss der gewählte Visualisierungstechnik, wie Immunzytochemie, in situ Hybridisierung, etc.) <ol><li> Platzieren Embryonen in einer 35 mm Petrischale mit Puffer der Wahl (1A) gefüllt. Die Wahl der Puffer in der Kennzeichnung Verfahren. Typischerweise PBS-basierten Puffer sind geeignet. </li><li> Unter einem Binokular und mit einer Pinzette, sichern Sie den Kopf mit einer Zange und ziehen Sie das Eigelb weg mit dem anderen Paar (Abbildung 1B). Alternativ können Sie auch ein Insektenstift in einer Insektenstifthalter vorsichtig wegziehen das Eigelb. </li><li> Mit dem Embryo Poker (Angelschnur (0,41 mm Durchmesser) geklebt, um entweder eine Kapillare oder eine Pasteur-Pipette) bewegen die Embryonen auf einen Teil der Petrischale, die nicht über eine Menge von Schutt Eigelb (1C-D). </li><li> Mit einem Glas Pasteur Pipette absaugen die Embryonen in so wenig Flüssigkeit wie möglich und gständig pipettieren sie auf einen Objektträger (1E). </li><li> Sanft Docht entfernt überschüssige Flüssigkeit mit einem Labortuch. Kontakt mit Embryonen vermeiden. </li><li> Einen Tropfen Eindeckmedium auf Embryonen. Für Fluoreszenzmarkierungen, verwenden Sie ein Antifade Reagenz der Wahl. Für kolorimetrische Signale kann 70% Glycerin als Befestigungsmedium verwendet werden. </li><li> Mit dem Embryo Poker, orientieren die Embryonen auf ihren Seiten in Reihen (1F). </li><li> In einem &quot;dab&quot; Vaseline oder Hochvakuumfett auf jeder Ecke einem Deckglas (1G). Dies verhindert eine Beschädigung des Embryos vor übermäßiger Kompression. </li><li> Deckglas (Vaseline Seite nach unten) auf der Oberseite der Embryonen (1H). </li><li> Klopfen Sie leicht das Deckglas an jeder Ecke, bis die Montage Medien (70% Glycerin oder anti-fade Montage Reagenz) wird das Deckglas (1H) zu berühren. </li><li> Falls erforderlich, mehr Montage Medien durch Pipettieren direkt neben dem coverslip, mit einer Pipette in einem Bereich von 20 bis 200 ml. Es wird unter Docht. </li><li> Mit einem Labortuch, ganz sauber auf der Deckglas. Seien Sie sicher, um Druck auf das Deckglas nicht zu, da diese Embryonen schädigen. Dieser Bereich muss trocken sein und haben keine Vaseline oder Montage Medien auf sie. </li><li> Verwenden Sie Nagellack um den Rand des Deckglases (1I) abzudichten. </li></ol>

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	<li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal.">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons.">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li><li>Ross, A. B. 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Keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen entweder Autor.

Seitlicher Anbau von festen Zebrafischembryonen Hilfen Visualisierung von Rückenmark-Entwicklung. Durch die Entfernung des Dotterkugel, wird der für außergewöhnliche mikroskopische Bildgebung erforderlich Arbeitsabstand reduziert. Unsere repräsentative Ergebnisse wurden mit der 24 hpf Stufe begrenzt, jedoch kann diese Technik schon HPF 18 verwendet werden, obwohl früher Embryonen sind schwieriger aufgrund der Größe des Embryos und der Zerbrechlichkeit des Gewebes zu sezieren. Diese Technik ist auch anwendbar auf Embryonen, die älter als 24 HPF. Durch die optische Klarheit des embryonalen Zebrafisch, der Fähigkeit, zukunfts genetischen Screens durchführen, Reverse Genetik und transgene Ansätze unterstützt, kann mehrere Entwicklungsprozesse untersucht werden. Dies beinhaltet Mitoseindices der neuronalen Vorläuferzellen mit Markierungen wie BrdU-und Anti-Phospho-Histon-März 4-06 und Strukturierung durch Expression von neuronalen und glialen Vorläufer Marker in der pax, nkx, dbx, und olig families 1,4-6. Reagenzien, Gliazellen und neuronale Bestimmung (wie gliafibrilläres-Protein (GFAP) und HuC / D) berichten 1,4,5,10 verwendet werden können. Neuronale Differenzierung Subtyp kann durch Expression von Insel, VSX, engrailed und gata 1,4-6 Gene analysiert werden. Und schließlich ist die Analyse der Axon Führung durch Antikörper, wie anti-acetyliertes Tubulin, 3A10 und ZNP-1 2,11,12 möglich. Obwohl andere Wirbeltiermodellsysteme (Maus und Küken) werden verwendet, um das Rückenmark Entwicklung zu studieren, nur der Zebrafisch erlaubt den gleichzeitigen Empfang von allen Entwicklungs Achsen in der intakten Embryo. Die offensichtliche Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass die Embryonen festgelegt sind, die die Live-Darstellung ausschließt. Tatsächlich Entfernen (oder Beschädigung) der Dotter führt zu einem schnellen Tod des Embryos, ist es somit nicht möglich, den Arbeitsabstand in lebenden Embryos unter Verwendung dieser Technik zu reduzieren. Allerdings hoher Vergrößerung Rücken Cord Bildgebung in lebenden Embryonen möglich ist. Um das Eigelb bei Live-Bildgebung zu erhalten, können Embryonen in Depression Dias, die einen größeren Abstand zwischen der Probe und dem Deckglas bieten platziert werden. Alternativ können mehrere 22 mm x 22 mm Deckgläsern auf beiden Schlitten in einer 3 x 1 in Objektträger geklebt werden. Die Deckgläser dienen als &quot;Brücke&quot; für die darüberliegenden Deckglas. Wenn Embryonen sind älter als 18 hpf ist Tricaine verwendet, um Embryonen zu betäuben, um die Bewegung zu verhindern. Während ein Arbeitsabstand von 0,288 mm für deyolked Embryonen bei 24 hpf erforderlich, wenn mit lebenden Embryonen in Agarose eingebettet, mit intakten Eidotter, eine Mikroskoplinse mit einem Arbeitsabstand von 3,3 mm ausreichend. Alternativ kann Explantatkulturen deyolked aus Embryonen gewonnen mittels eines Plasmagerinnsel Immobilisierungstechnik 13 visualisiert werden. Verschiedene Populationen von Zellen durch die Verwendung von genetisch kodierte fluoreszierende Proteine ​​wie GFP, mCherry oder der photo beachtenWandel Kaede Farbstoff (um nur einige zu nennen). Ferner kann fluoreszenzmarkierten Zellen in chimären Embryonen auch mit diesem Ansatz 14 gesehen werden. Eine konsequente Montagetechnik, die für Monate stabil ist, ist ein wichtiges Werkzeug für Zell-und Entwicklungsbiologen. Diese einfache Technik ist reproduzierbar, was eine einfache Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Studien. Ferner wird die Ausrichtung der Embryonen in Reihen leicht ermöglicht Identifizierung spezifischer Embryonen für eine spätere Analyse.

Visualisierung des Rückenmarks im Zebrafisch ist durch eine Anzahl von Faktoren gehemmt. Aufgrund der Dicke der darüberliegenden Somiten und der inneren Lage des Rückenmarks ist eine beträchtlich lange Arbeitsabstand für Hochzellauflösung erforderlich. Der Dotterkugel (die noch während der frühen Stadien der Neurogenese vorhanden ist) erhöht weiter die erforderlichen Arbeitsabstand und ist leicht durch Druck von einem Deckglas beschädigt. Außerdem Trümmer von beschädigten Eigelb verbietet klare Visualisierung von Geweben. Obwohl Querschnitte in den dorso-ventralen (DV) Achse möglich sind, sie nicht leicht eine gleichzeitige Visualisierung in der anterior-posterior (AP) Achse 1. Um diese Hindernisse zu überwinden, werden Embryonen präpariert und auf Objektträger aufgebracht. Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile. Erstens liegen Zebrafischembryonen leicht mit der lateralen Seite nach oben, die AP-Achse Visualisierung erleichtert. Zweitens die Entfernung des Eigelbs ball verringert die erforderlichen Arbeitsabstand und begrenzt Schutt. Drittens erlaubt sowohl für Fluoreszenz-und Hellfeldmikroskopie das Montageverfahren zu. Viertens sind montiert Embryonen Monate stabil bei 4 ° C, wodurch längere Probe Visualisierung. Schließlich, daß vorderen Segmente auftritt Fortschreiten der Entwicklung sind reifer als Zahnbereich. Um sicherzustellen, dass inszeniert abgestimmt Rücken hemisegments zwischen Embryonen verglichen wird, wird überlagert Somitengewebe als Richtlinie. Zum Beispiel liegt über der zehnte hintersten Somiten den zehnten Rücken hemisegment, die entwicklungs Äquivalent in der Stufe abgestimmt Embryonen ist. Dieses Montageverfahren von intakten Embryonen ermöglicht die einfache Identifizierung von Somiten. Wir verwenden Genetik und Gen-Knock-down-Technologien, um die Mechanismen der Axon-Führung in der Entwicklung des Rückenmarks zu studieren. Insbesondere haben wir festgestellt, dass robo2, robo3 und DCC für Commissural Primär Asce erforderlichNding (COPA) Axon-Wegfindung. Mit der hier beschriebenen Montageverfahren, waren wir in der Lage, ventralen Wachstum, Mittellinienüberfahrt, commissure Breite, Rücken-und Vorder Wachstum 2,3 zu untersuchen. Dieses Montageverfahren kann auch auf DV-oder AP-Musterbildung des Rückenmarks eingesetzt werden. Wir haben dieses Verfahren verwendet, um unterschiedlichen Rollen von Wnt nachgeschalteten Effektoren in DV Strukturierung des Rückenmarks zu bestimmen. Mit dieser Montage, waren wir in der Lage, DV-Auflösung von Markern auf Einzelzellebene zu erhalten, und zu bestimmen, Minute Musterverschiebungen als Folge der veränderten Wnt-Signalempfang 4,5. Dieses Montageverfahren ermöglicht auch mitotische Indexberechnung durch anti-phosphohistone 3 oder BrdU-Markierung (Vorläufer Proliferation) 5 Differenzierung.

<table><tbody><tr><td>&lt;p&gt;Petri dishes 35 mm x 10 mm&lt;/p&gt;</td><td>VWR</td><td>&lt;p&gt;25373-041&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Dumont Forceps #3&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;NC9839169&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Cover glass&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;12-541-B22X22-1.5&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Slides&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;12-550-343&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;SlowFade Gold&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;S36936&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;ProLong Gold&lt;/p&gt; </td><td>Life Technologies</td><td>&lt;p&gt;P36934&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Petroleum Jelly&lt;/p&gt; </td><td>any grocery store</td><td>&lt;p&gt; &lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Loop Holders&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p&gt;80094-482&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Insect Pins&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;26002-10&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Nickel Plated Pin Holders&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;26016-12&lt;/p&gt; &lt;p&gt; &lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;Olympus Stereomicroscope&lt;/p&gt;</td><td>Olympus</td><td>&lt;p&gt;SZ61&lt;/p&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development

Der Zebrafisch Rückenmark ist eine effektive Untersuchungsmodell für Systemforschung Nerven aus mehreren Gründen. Erstens kann genetische, transgene und Gen-Knockdown Ansätze genutzt werden, um die molekularen Mechanismen, die der Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Zweitens großen Fängen der entwicklungs synchronisiert Embryonen bieten großen Versuchsprobengrößen. Drittens, die optische Klarheit des Zebrafischembryos erlaubt Forschern Vorläufer, glialen und neuronalen Populationen zu visualisieren. Obwohl Zebrafischembryonen transparent sind, können Probendicke wirksam mikroskopische Visualisierung behindern. Ein Grund dafür ist die Entwicklung von Tandem-Rückenmark und darüberliegenden Gewebe Somiten. Ein weiterer Grund ist die große Dotterkugel, die noch in Zeiten der frühen Neurogenese vorliegt. In diesem Artikel zeigen wir, Mikrodissektion und die Entfernung der Dotter in festen Embryonen, die mikroskopische Visualisierung ermöglicht es, während das umliegende Gewebe Somiten. Wir ALSo zeigen, semipermanente Befestigung von Zebrafischembryonen. Dies ermöglicht eine Beobachtung der Entwicklung des Nervensystems in den dorso-ventralen und anterior-posterioren Achsen, da sie die Dreidimensionalität des Gewebes bewahrt.

Bei der Aufklärung der Mechanismen, die verschiedenen Entwicklungsereignisse wie Zellmusterungs, Differenzierung und Axon Führung unterliegen, ist es wichtig, in der Lage, Zellen, die im Rahmen ihrer Gewebe zu visualisieren. Dorsoventraler Strukturierung Mängel in der Regel als eine ventrale oder dorsale Verschiebung der Expressionsdomäne von Transkriptionsfaktoren in der pax, nkx oder dbx Familien 4 vorhanden. Manchmal können Veränderungen subtil sein, das nur wenige Zelldurchmesser 4. Querschnittsanalyse ermöglicht diese Art der Analyse. Jedoch können Reagenzien mit schwächeren Signalen oder Querschnitte, die nicht senkrecht zu der Achse AP Interpretation beschränken. Ferner Querschnittsanalyse nicht ohne zu berücksichtigen, ob Änderungen bestehen in der AP-Achse, und ist auf die Verfügbarkeit eines Kryostaten. Diese Einschränkung wird durch Seitenansichten des Rückenmarks umgangen. Wie in 2B zu sehen ist, ist nkx6.1 mRNA detwa in der ventralen Hälfte des Rückenmarks bei 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) istributed, in der Vorläuferdomäne. Vorläuferzellen unterscheidbar von Post mitotischen Zellen aufgrund des Vorhandenseins der Bodenplatte, die im medialen Teil des Rückenmarks zu finden ist. Mit DIC Optik angesehen werden einzelne Zellen deutlich unterscheidbar, und eine definierte Grenzfläche zwischen exprimierenden und nicht exprimierenden Zellen, ist offensichtlich. Austrittsvorläuferzellzyklus wird durch Veränderungen in der Genexpression begleitet. Zum Beispiel werden alle post-mitotischen Neuronen auszudrücken HuC / D, die mit Immunzytochemie 1,5 nachweisbar ist. mRNA-Sonden für die Insel, gata und VSX Familien beschriften spezifische post-mitotischen Neuronen konsequente Position und Anzahl in jeder Rückenmark hemisegment 6. Zusätzlich werden Axon Führung Rezeptoren, wie sie in der Robo-Familie in begrenzten Populationen von postmitotischen Neuronen (2C) <sup&gt; 2,7,8. Seitlicher Anbau von Embryonen erlaubt eine genaue Zählungen der post-mitotischen Neuronen. Ebenso können Vorläuferzellen sich zu teilen, die weiterhin mit Anti-Phospho-Histon-3 Immunzytochemie sowie BrdU-Markierung quantifiziert werden. Weiterhin kann Zelltod mit TUNEL Kennzeichnung 4-6 bewertet. Bei 24 hpf können Axone der folgenden postmitotischen Neuronen mit verschiedenen Methoden sichtbar gemacht werden, und unterscheiden sich in der Einzelzellebene: Seitliche Rücken Aufsteigend (Dola), Commissural Primär Aufsteigend (COPA), Commissural Sekundär Aufsteigend (CoSA), ventrale Längs Absteigend (Steppe), Kolmer-Agdur (KA), Commissural gegabelten / Längs (CoB / L), Umlauf Aufsteigend (CiA), Umlauf absteigend (CID) und unipolar Commissural absteigend (UCoD), Rohon-Bart (RB), Motoneuronen ( M) 9. Axone verlaufen von dieser Neuronen im dorsalen, ventralen, vorderen und hinteren Richtungen. Sie Niederlassung, über die Mittellinie, und beenden Sie sowohl die Rückenund ventralen Rückenmark. In Verbindung mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie sind diese vielfältigen zellulären Verhaltensweisen deutlich in seitlich angebrachten Embryonen mit Hilfe der Immunzytochemie und genetisch kodierte Fluoreszenzproteine ​​wie GFP 2. In 2D wurde ZNP-1 Immunzytochemie verwendet werden, um die Entwicklung Motoneuronen zu beschriften. Motoneuronen verlassen das Rückenmark ventral um die umliegende Muskulatur innervieren entwickeln. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. Präparation und Montage seitlich von Zebrafischembryos. (A) Nach der Verarbeitung für Immunfluoreszenz in situ-Hybridisierung, etc., sind Embryonen in einer 35 mm Petrischale mit PBT gefüllten (PBS mit 0,5% Triton X-100) oder PTW (PBS mit platziert 0,1% Tween-20). Das EigelbBall (YB) ist offensichtlich. (B) Das Eigelb wird durch die Sicherung der Kopf des Embryos, gefolgt von sorgfältig seziert und entfernt. (C) Ein Embryo Poker (Angelschnur an einer Pasteur-Pipette aufgeklebt) auf separaten Embryonen und Eigelb Schutt (D) verwendet. Gereinigt Embryonen werden auf einen Mikroskop-Objektträger (E) pipettiert und ausgerichtet (F). (G) Vaselin an den Ecken des Deckglases aufgebracht. (H) Das Deckglas wird sanft auf der Embryonen in Montagemedium platziert. (I) Nagellack verwendet, um die Kanten des Deckglases zu versiegeln. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Abbildung 2. Analyse von Genexpressionsmustern und Axon Pathfinding in seitlich angebrachten Zebrafischembryonen. (A) Zeichnung eines Zebrafischembryos bei 24 hpf. In BD, sind etwa vier hemisegments über dem Dottersack-Erweiterung visualisiert (boxed-Bereich). (B) nkx6.1 wird im ventralen Rückenmark, einschließlich der Bodenplatte (FP) ausgedrückt. (C) robo3 in postmitotischen Neuronen (PMN) ausgedrückt. Die Bodenplatte und Vorläuferzone ist nicht ersichtlich, in diesem mehr seitliche Brennebene. In B, C, das Rückenmark durch eine Klammer auf der linken Seite des Bildes begrenzt. (D) Die konfokale Mikroskopie wurde an Bild ZNP-1-Immunfluoreszenz, der Motor Axone verlassen das Rückenmark ventral-Etiketten eingesetzt. In allen Abbildungen ist anterior der linken und dorsalen liegt. A 40X großen Arbeitsabstand, Eintauchen in Wasser (NA 0,8) Objektiv verwendet wurde (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Entwicklungsprozesse wie Proliferation, Strukturieren, Differenzierung und Axon Führung leicht im Zebrafisch Rückenmark modelliert werden. In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafisch-Embryonen, die Visualisierung dieser Ereignisse optimiert.

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Aufrufe.  Skidmore College.  Entwicklungsprozesse wie Proliferation, Strukturieren, Differenzierung und Axon Führung leicht im Zebrafisch Rückenmark modelliert werden. In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafisch-Embryonen, die Visualisierung dieser Ereignisse optimiert. 

Serie: Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologie

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained even in embryos that are larger or smaller, within certain limits. Although this phenomenon of scaling has attracted attention for over a century, understanding the underlying mechanisms has been limited, owing in part to a lack of quantitative description of developmental dynamics in embryos of varied sizes. To overcome this limitation, we developed a new technique to surgically reduce the size of zebrafish embryos, which have great advantages for in vivo live imaging. We demonstrate that after balanced removal of cells and yolk at the blastula stage in separate steps, embryos can quickly recover under the right conditions and develop into smaller but otherwise normal embryos. Since this technique does not require special equipment, it is easily adaptable, and can be used to study a wide range of scaling problems, including robustness of morphogen mediated patterning.&#160;

Here, we describe a method for reducing the size of zebrafish embryos without disrupting normal developmental processes. This technique enables the study of pattern scaling and developmental robustness against size change.

Chirurgische Größenreduktion von Zebrafischen für die Erforschung der embryonalen Muster Skalierung

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Neurowissenschaften

A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from the presomitic mesoderm (PSM) as the tail end of the embryo elongates posteriorly. Somites form with regular periodicity and scale in size. Zebrafish is a popular model organism as it is genetically tractable and has transparent embryos that allow for live imaging. Nevertheless, during somitogenesis, fish embryos are wrapped around a large, rounding yolk. This geometry limits live imaging of PSM tissue in zebrafish embryos, particularly at higher resolutions that require a close objective working distance. Here, we present a flattened 3-D tissue culture method for live imaging of zebrafish tail explants. Tail explants mimic intact embryos by displaying a proportional slowdown of axis elongation and shortening of rostrocaudal somite lengths. We are further able to stall axis elongation speed through explant culture. This, for the first time, enables us to untangle the chemical input of signaling gradients from the mechanistic input of axial elongation. In future studies, this method can be combined with a microfluidic setup to allow time-controlled pharmaceutical perturbations or screening of vertebrate segmentation without any drug penetration concerns.

Here, we present the protocol for 3-D tissue culture of the zebrafish posterior body axis, enabling live study of vertebrate segmentation. This explant model provides control over axis elongation, alteration of morphogen sources, and subcellular resolution tissue-level live imaging.

Eine 3D-Schwanz-Explant-Kultur zur Untersuchung der Wirbeltiersegmentierung bei Zebrafischen

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Wohnung Berge Vorbereitung für Beobachtung und Analyse der Zebrafisch-Embryo Proben von Bunt Ganze Berge<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Dissection und seitlicher Anbau von Zebrafisch-Embryonen: Analyse der Rückenmarksentwicklung

Zusammenfassung

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