Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gesunde akute Scheiben aus der dorsalen Zwischenregion des Hippocampus für Langzeitaufnahmen und Rekonstruktion enthonen Neuronen bei erwachsenen Mäusen vorzubereiten. Viele Laboratorien wie unsere, studieren dorsalen Hippocampus für seine Rolle in speziellen Lernen und Navigation. Häufige Techniken, die zu diesem Zweck verwendet werden, sind Verhaltensexperimente, anatomische Tracing und regionalspezifische Manipulationen.
Wir haben eine Gehirn-Slicing-Methode entwickelt, um Elektrophysiologie mit diesen Techniken zu kombinieren, um eine direkte Korrelation von Invivodaten innerhalb von Videoaufzeichnungen zu ermöglichen. Der Vorteil dieses Protokolls ist, dass es ein einfaches Verfahren kombiniert, um transversale Scheiben mit der Verwendung von Schutzlösung zu erhalten, um die Lebensfähigkeit von Hirngewebe zu verbessern. Dieser Ansatz eignet sich besonders, wenn reife Tiere wie bei Verhaltensexperimenten eingesetzt werden.
Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie neben der Spüle die notwendige Ausrüstung für diesen Abschnitt vor. Bereiten Sie auf Eis einen 150 Milliliter Becher und zwei Glas Petrischalen mit einem Durchmesser von je 10 Zentimetern zu. Zeichnen Sie drei Teile der Linien bis zum Boden einer Kunststoff-Petrischale und positionieren Sie diese Schale in der Nähe der Eisschale.
Sie benötigen auch Kleber und den Probenhalter für das Vibratome. Dann statte die Operationsbank mit einer großen Schere, einer kleinen Schere, einer abgerundeten Zehenpinzette, einer feinen Spitzenpinzette, einem dünnen Metallspachtel, einem großen Metallspachtel und Transferpipetten aus. Die Petrischalen mit einer Schneidlösung schälen.
Eine Schale, um die Zerlegung des Kopfes durchzuführen und die andere für die Zerlegung des Gehirns. In letztere, auch ein Stück Filterpapier platzieren. Füllen Sie den Becher auch mit 30 Milliliter Schneidlösung.
Dies wird für die Transkardialperfusion benötigt. Füllen Sie das Vibramtablett mit eiskalter Schneidlösung und halten Sie die gesamte Lösung mit einem Carbogen-Sprudelgerät sauerstoffhaltigen Behältern. Fügen Sie das zerkleinerte Eis aus der gefrorenen Charge der Schneidlösung in die kalte frische Einschnittlösung ein, um die Temperatur niedrig zu halten.
Achten Sie darauf, das Eis beim Schneiden von der Klinge fernzuhalten. Fast alle Schritte nach der Capitation werden innerhalb der Lösungen durchgeführt. Dies hilft, den Stoffwechsel Sauerstoffmangel auf ein Minimum zu halten.
Bereiten Sie eine Inkubationskammer vor, die mit einer Schneidlösung unter konstanter Sauerstoffversorgung gefüllt ist. Legen Sie die Kammer in ein vorgewärmtes Wasserbad bei 35 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Scheibenlagerkammer mit mehreren unabhängigen Brunnen vor und füllen Sie sie mit Aufbewahrungslösung.
Halten Sie es unter konstanter Sauerstoffversorgung bei Raumtemperatur. Für den Fall, dass das Gewebe ein fluoreszierendes Protein oder ein lichtaktiviertes Opsonin ausdrückt. Es empfiehlt sich, die Kammer im Dunkeln zu halten.
Zum Beispiel innerhalb des Feldes. Nach der Durchführung der Transkardialperfusion den Mauskopf mit der eiskalten Schneidlösung in die Petrischale legen. Öffnen Sie die Haut mit einer feinen Schere, um den Schädel freizulegen.
Beginnend mit dem Foramen magnum, entlang der sagittalen Naht schneiden, bis die nasofrontale Naht erreicht. Achten Sie darauf, die Schere leicht nach oben zu ziehen, um Schäden des Gehirns zu vermeiden. Machen Sie zwei seitliche Einschnitte in die Basis des Schädels.
Verwenden Sie die abgerundete Spitzenpinzette, um die parietalen Knochen hochzuziehen. Achten Sie darauf, auch die Meningen zu entfernen. Wenn sie links sind, können sie das Gehirn während der Extraktion schädigen.
Verwenden Sie den kleinen Spachtel, um das Gehirn sanft von der Schädelbasis zu lösen. Mit einem kleinen Spachtel das Gehirn von den Hirnnerven lösen und das Gehirn auf ein kleines Stück Filterpapier in der zweiten Petrischale übertragen. Schneiden Sie das Gehirn in Hälften entlang der Längsspalte mit einer vorgekühlten Klinge.
Trennen Sie die beiden Hemisphären mit dem kleinsten Spachtel. Verwenden Sie den größten Spachtel, um eine Hemisphäre auf die Kunststoff-Petrischale mit ihrer medialen Oberfläche nach unten zu übertragen. Richten Sie den parietalen Kortex an einer der parallelen Linien aus, um eine Referenz für den zweiten Schnitt zu haben.
Verwenden Sie ein Stück Filterpapier, um überschüssige Lösung zu trocknen. Positionieren Sie die Klinge parallel zu den Linien und schneiden Sie den ventralen Teil der Hemisphäre. Diese flache Oberfläche wird später auf den Probenhalter geklebt.
Geben Sie die Hemisphäre in die sauerstoffhaltige Baumwolllösung der Glas-Petrischale zurück und führen Sie das gleiche Verfahren auf der zweiten Hemisphäre durch. Legen Sie einen Tropfen Cyanoacrylatkleber auf den Vibram-Probenhalter und verteilen Sie ihn mit einem Spachtel, um eine dünne Schicht zu erzeugen. Übertragen Sie die Halbkugel mit der ventralen Seite nach unten mit der abgerundeten Seite des Spachtels auf den Vibramhalter.
Das Starten dieses Schneidens aus dem parietalen Kortex würde die Zeit reduzieren, die benötigt wird, um die dorsale Region des Hippocampus zu sammeln. Fügen Sie ein paar Tropfen Kaltschnittlösung hinzu, um den Kleber zu erstarren. Bewegen Sie den Probenhalter in das Vibram-Tablett und schneiden Sie das Gehirn mit entsprechenden Einstellungen in Scheiben, bis der Bereich des dorsalen Hippocampus sichtbar ist.
Dann sammeln Sie die Scheiben mit der Verwendung einer Kunststoff-Transferpipette. Jede Scheibe in die Inkubationskammer geben und 12 Minuten ruhen lassen. In der Zwischenzeit fahren Sie mit dem Schneiden der nächsten Scheiben fort.
Nach der 12-minütigen Inkubation die Scheiben in die Lagerkammer geben. Und lassen Sie es bis zum Beginn des Experiments ruhen. Um die Reinheit unserer Zubereitung zu demonstrieren, vergleichen wir sie mit einem koronaren Präparat, das häufig verwendet wird, um vom dorsalen Hippocampus aufzunehmen.
Gezeigt werden hier Differentialinterferenz kontrast-Mikrograph von der oberen Klinge des Dentate Gyrus in akuten Scheiben von zwei Monate alten Mäusen erworben. In der transversalen Scheibe zeigten die Neuronen meist glatte Oberflächen und nur wahrscheinlich kontrastierte Ränder, die durch schwarze Pfeile gekennzeichnet waren. Neuronen in koronalen Scheiben jedoch oft erschienen Kurs und zeigten stark kontrastierte Umrisse, durch weiße Pfeile angezeigt.
Dies deutet auf eine bessere Lebensfähigkeit der Neuronen in der transversalen Scheibe hin. Entsprechend diesem Eindruck war die durchschnittliche Zeit zum Versiegeln der Bildung beim Patchen in unseren Querscheiben deutlich schneller als in den koronalen Scheiben. Als allgemeiner Proxy für die Zellintegrität zeichnen wir auf, dass die ruhenden Membranpotentiale von Granulatzellen und Parvalbumin-positiven Interneuronen, die bei beiden Zelltypen in koronalen versus transversalen Scheiben deutlich mehr depolarisieren.
Was am Ende zu deutlich mehr Zellen führte, die in der koronalen Präparation ausgeschlossen werden mussten. Da Granulatzellaxone in der Transversalebene verlaufen, führte die Rekonstruktion der aufgezeichneten Zellen in unserer Vorbereitung zur Vollständigen Axonalarborisation. Dies war nicht der Fall bei koronaren Scheiben, in denen die Axone leicht abgetrennt worden sein könnten.
Darüber hinaus ermöglichte die morphologische Rekonstruktion von Parvalbumin-positiven Interneuronen in transversalen Scheiben die Darstellung einer ausgedehnten axonalen und dendritischen Arborisierung, einschließlich der Visualisierung kleiner Details, wie dendritischen Stacheln. Insgesamt haben wir eine Schneidmethode vorgestellt, um transversale Hippocampus-Scheiben mit hoher neuronaler Lebensfähigkeit für erwachsene Mäuse zu erhalten. Diese Methode kann verwendet werden, um elektrophysiologische In-vitro-Untersuchungen mit anatomischen und Verhaltensstudien zu messen, die sich auf den zwischengeschalteten dorsalen Teil des Hippocampus konzentrieren.
