Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein JSPS KAKENHI-Stipendium der Japan Society for the Promotion of Science (Nr. 19K10397 an H.K. und Nr. 18K09862 an I.M.) unterstützt.

Alle Tierbehandlungen und die Tierpflege wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Tohoku-Universität durchgeführt.
1. Sektion der neugeborenen dmp1-Topas-Maus Calvaria
<ol><li>Verwenden Sie für dieses Protokoll 6 bis 7 Tage alte Welpen von C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J-Mäusen. Euthanasieren Sie Mäuse mit 5% Isofluran-Inhalation und setzen Sie die Welpen dann in 70% Ethanol um.</li>
	<li>Übertragen Sie den eingeschläferten Welpen in eine unbehandelte Kulturschale.</li>
	<li>Fassen Sie mit Schere und Pinzette die Haut an der Schädelbasis und machen Sie einen Schnitt.</li>
	<li>Schneiden Sie mit dem ersten Schnitt als Ausgangspunkt auf beiden seitlichen Seiten des Schädels vor den Ohren, entfernen Sie die Haut und legen Sie die Schädeldecke frei.</li>
	<li>Halten Sie den Kopf vom Nasenrücken und schneiden Sie die Schädeldecke entlang der Lambdoidnaht. Schneiden Sie entlang der seitlichen Ränder der Scheitelknochen und verlängern Sie sie bis zum vorderen Teil.</li>
	<li>Trennen Sie den Schädeldach vom darunter liegenden Hirngewebe. Anmerkungen: Um eine saubere knöcherne Schädeldecke mit minimalem Weichteilansatz zu gewährleisten, schneiden Sie nicht tief in den Knochen ein. Als Referenz sollte man in der Lage sein, den Schatten der Schere unter dem Knochen zu sehen.</li>
	<li>Übertragen Sie den Schädeldeckel in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4 während des gesamten Protokolls). Stellen Sie sicher, dass der konkave Teil nach oben zeigt.</li>
</ol>2. Fraktionierung der Schädeldecke von neugeborenen Mäusen
<ol><li>Übertragen Sie bis zu 5 Calvariae in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 5 ml 2 mg/ml Kollagenase-Lösung. Verwenden Sie frische Kollagenase-Lösung, die kurz vor der Anwendung zubereitet wird.<ol><li>Zur Herstellung einer frischen Kollagenaselösung wird Kollagenasepulver in den Isolationspuffer (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM Sorbitol,3 mMK2HPO4, 1 mM CaCl 2, 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 5 mg/ml Glukose und 25 mM HEPES) mit2 mg/ml gegeben. Das Kollagenase-Pulver auf einem Magnetrührer auflösen.</li>
		<li>Lassen Sie die Kollagenaselösung durch eine 0,22 μm sterile Filtereinheit in ein 50-ml-Röhrchen laufen und bewahren Sie sie während des gesamten Protokolls auf Eis auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubieren Sie den Schädeldach bei 37 °C für 20 Minuten auf einem Schüttler bei 300 U/min, um Fraktion 1 zu erhalten.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Aufschluss von Fraktion 1, waschen Sie die Schädeldecke mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entsorgen Sie die Wäsche.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Schädeldach in 5 ml 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit 1 mg/ml BSA in PBS, PH 7,4 bei 37 °C für 15 min auf einem Schüttler bei 300 U/min.</li>
	<li>Sammeln Sie den Aufschluss in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Waschen Sie den Golgatha mit 5 ml PBS und fügen Sie die Waschlösung dem Aufschluss hinzu. Anmerkungen: Pipettieren Sie die Knochen an jedem Punkt des Sammelns und Waschens in ihrer Lösung, um die Zellen vom Knochen zu lösen und Dubletten und Zellaggregate zu verhindern.</li>
	<li>Um Fraktion 2 zu erhalten, wird der Aufschluss bei 300 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet erneut in 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM), das 10 % fötales Kälberserum (FBS), 100 I.E./ml Penicillin G und 100 μg/ml Streptomycin enthält. Auf einer 10 cm Kulturschale aussäen. Fraktion 2 bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schädeldecke in 5 ml Kollagenaselösung bei 37 °C für 20 min auf einem Shaker bei 300 U/min.</li>
	<li>Um Bruch 3 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 2.6. Fraktion 3 bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren. HINWEIS: An diesem Punkt werden die Knochen kleiner und sie werden in Fragmente zerlegt. Um sicherzustellen, dass keine Knochen versehentlich in die Verdauungen abgesaugt werden, was zu Zellverlust führt, verwenden Sie eine kleine Spitzenpipette zum Auffangen der Verdauungen (1000\u2012200 μL Pipettenspitzen).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Schädeldecke in 5 ml Kollagenaselösung bei 37 °C für 20 min auf einem Shaker bei 300 U/min.</li>
	<li>Um Bruch 4 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 6. Fraktion 4 bei 37 °C unter 5% CO2 inkubieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Schädeldeckel in 5 ml 5 mM EDTA mit 1 mg/ml BSA in PBS (pH 7,4) bei 37 °C für 15 Minuten auf einem Schüttler bei 300 U/min.</li>
	<li>Um Bruch 5 zu erfassen, wiederholen Sie die Schritte 2.5 bis 20122.6. Fraktion 5 bei 37 °C unter 5 % CO2 inkubieren. Osteozyten können noch am selben Tag für die Sortierung vorbereitet oder bis zu 24 Stunden vor der Sortierung kultiviert werden.</li>
</ol>3. Vorbereitung von Osteozyten für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung
<ol><li>Aspirieren Sie das Medium jeder Zellfraktion und waschen Sie es vorsichtig zweimal mit 10 ml PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 5 ml 0,5%iges Trypsin-EDTA in PBS hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 °C. Fügen Sie 5 ml 10% FBS α-MEM hinzu und pipettieren, um die Zellen sanft zu lösen. Kombinieren Sie die Zellen in jeder Fraktion, indem Sie sie durch ein 40-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen sieben.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS und sammeln Sie sie, indem Sie sie durch ein 40-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen sieben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie dem Pellet 10 % FBS α-MEM hinzu. Stellen Sie die Zellkonzentration auf ca. 1 x 107 Zellen/ml ein.</li>
	<li>Filtern Sie die Zellen in einem 35 μm dicken Röhrchen mit Nylonnetzverschluss. Die Zellen sind nun bereit für FACS.</li>
	<li>Verwenden Sie für dieses Protokoll eine Düse mit einer Größe von 100 μm. Die Sammelflüssigkeit sollte zu 10 % aus FBS α-MEM bestehen. Halten Sie die zu sortierende Probe unter Rühren und wenn möglich bei 4 °C.</li>
	<li>Optimieren Sie vor dem Sortieren das Gating, um Artefakte und Zellen zu entfernen, indem Sie den SSC-Bereich (Side Scatter) und den FSC-Bereich (Forward Scatter) anpassen. Eliminieren Sie Dubletten, indem Sie SSC-Breite vs. SSC-Höhe und FSC-Fläche vs. FSC-Breite anpassen. GFP-negative Osteozyten sollten als Kontrolle verwendet werden, um die Parameter des Sortierinstruments einzustellen.</li>
	<li>Nachdem die Zellentnahme abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 10 Minuten. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei 4 °C für 5 min.</li>
	<li>Suspendieren Sie die Zellen erneut und passen Sie die Anzahl mit 10 % FBS-α-MEM wie gewünscht an.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+and+death+of+bone+cells:+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis.">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells.">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes.">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice.">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Osteocyte:+An+Endocrine+Cell+...+and+More.">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+osteocytes.">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li><li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein.">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li><li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikk&#246;, K., V&#228;&#228;n&#228;nen, H. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line,+MLO-Y4.">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture.">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li><li>Zhang, C., Bakker, A. 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P., Varma, S., Gottesman, M. 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Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes.">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li><li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M., Helfrich, M. H., Ralston, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bone Research Protocols. , 55-66 (2012).</li><li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone.">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der erste isolierte Osteozyten stammte aus einer Huhn-Calvaria7 , die mit Hilfe von (OB7.3) oder der avianten Variante von PHEX isoliert wurde. Diese Methode ist jedoch durch die Verfügbarkeit von praktikablen Antikörpern begrenzt, da Osteozyten-spezifische Antikörper hergestellt werden müssen, die auch speziesspezifisch sind. Die Forscher verwendeten eine andere Modifikation des sequenziellen enzymatischen Prozesses, um Osteozyten aus langen Knochen von Mäusen und Ratten zu gewinnen. Die ber...

Osteozyten sind terminale differenzierte Zellen aus osteoblastischen Vorläuferzellen, die in ihre sezernierte Matrix eingebettet wurden1. Sie sind die am häufigsten vorkommenden und langlebigsten Zellen unter den Knochenzellpopulationen. Sie befinden sich in Lakunen und haben eine charakteristische Sternmorphologie mit Dendriten, die sich durch Kanäle erstrecken, die als Canaliculi bezeichnet werden und ein ausgedehntes Netzwerk der Kommunikation und des Stoffwechselaustauschs mit ihrer Umgebung und der Knochenoberfläche bilden2. Osteozyten choreografieren sowohl die Rolle von Osteoblasten als auch von Osteoklasten beim Knochenumbau, sie sind die primären mechanosensorischen Zellen, die die Anpassung an mechanische Belastungen gewährleisten3, sind an der Phosphathomöostase4 und der Knochenmatrixmineralisierung5 beteiligt und fungieren zusammen mit dem lakunokanalikulären System als endokrines Organ, das entfernte Gewebe signalisiert6.
Osteozyten befinden sich in einer mineralisierten Matrix, was die Zugänglichkeit einschränkt und ihre Isolierung erschwert, was die In-vitro-Untersuchung erschwert. Eine der ersten Isolierungsmethoden beschrieb isolierte Osteozyten aus Hühnerschädeln unter Verwendung eines osteozytenspezifischen monoklonalen Antikörpers (OB7.3)7 , von dem später bekannt wurde, dass es sich um die aviäre Variante von PHEX (PHosphate-regulierendes Gen mit Homologie zu Endopeptidasen auf dem X-Chromosom) handelte8. Andere Forscher verwendeten die sequentielle Verdauung von langen Knochen von Ratte9 oder Maus 10, um osteozytenreiche Fraktionen zu erhalten, bei denen die Reinheit der Osteozyten bei etwa70 % lag9. Zu den Einschränkungen dieses Verfahrens gehört die suboptimale Reinheit von Kulturen, die neben Osteozyten auch mit anderen Zelltypen kontaminiert sind, und dass Osteozyten möglicherweise von anderen Zellen in Kultur überwachsen werden könnten, da Osteozyten die Fähigkeit zur Teilung verloren haben. Diese Herausforderungen schränken die Nutzbarkeit langfristiger Kulturen ein.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden verschiedene Osteozytenzelllinien entwickelt. Die MLO-Y4-Zelllinie11 und die MLO-A5-Zelllinie12 sind insbesondere die am weitesten untersuchten Zelllinien, die für die Untersuchung der Osteozyten im Frühstadium nützlich sind. Sie sind jedoch weniger nützlich für die Untersuchung der Signalübertragung reifer Osteozyten, da sie geringe Mengen an Sclerostin und FGF2313 exprimieren, die beide reife Osteozytenmarker sind. Andere Zelllinien, darunter IDG-SW3 14 und Ocy45415, exprimieren hohe Konzentrationen von Sclerostin und FGF23 und sind nützlich für die Untersuchung des späten Osteozytenstadiums. Zelllinien erweisen sich als nützliche Forschungswerkzeuge; Dennoch sind sie nicht ohne Einschränkungen, da sie die Biologie der Primärzelle nicht vollständig repräsentieren. Unterschiedliche Zelllinien repräsentieren unterschiedliche Entwicklungsstadien des Osteozytenreifespektrums, und Zelllinien repräsentieren nicht die Heterogenität der primären Osteozyten16,17.
Um Reinkulturen von primären Osteozyten zu erhalten, nutzten die Forscher das cre-Mausmodell, in dem der 8-kb-dmp1-Promotor verwendet wird, um die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) in Osteozyten zu steuern18,19. Zwei transgene Mäuse (pOB-Col 2.3-GFP-cyan und DMP1-GFP-topaz) von Paic et al.19 und dmp1-topaz-transgene Mäuse von Nakashima et al.20 wurden verwendet, um Osteozytenpopulationen zu erhalten. Dabei nutzten sie die sequentielle Verdauung und das FACS von Osteozyten, die GFP exprimieren, um Kulturen von primären Osteozyten zu erwerben19,20. Es konnte gezeigt werden, dass die Richtung von cre in der 10-kb dmp1-Reportermaus Ai9, die das tdTomato-Protein aktiviert, in Osteozyten, Osteoblasten, Muskeln und Zellen im Knochenmark vorhanden ist. Der 8-kb dmp1-Promotor hatte das gleiche Expressionsmuster, aber nur ein Teil der Osteoblasten und Knochenmarkzellen exprimierte das Protein, was darauf hindeutet, dass der 8-kb dmp1-Promotor spezifischer ist21. Trotzdem sollten Ergebnisse, die mit dem 8-kb-dmp1-Promotor erzielt wurden, mit Vorsicht interpretiert werden, und Genexpressionsprofile sollten routinemäßig unter Verwendung von Osteozyten- vs. Osteoblasten-spezifischen Markern erstellt werden, um sicherzustellen, dass die erhaltene Population von ausreichend hoher Reinheit ist.
Die Osteoklastenmarker OSCAR und Dcstamp wurden in hämatopoetischen nicht depletierten vs. depletierten Osteozytenpopulationen gefunden, was die Autoren zu der Schlussfolgerung führte, dass Verdauen, die durch Fraktionierung von 8-kb dmp1-topas neonatalen Calvaria und GFP-Sortierung erhalten wurden, mit hämatopoetischen Zellen kontaminiert sind. Die Kontamination mit hämatopoetischen Zellen hätte durch eine Straffung des GFP-Sortiertors gemildert werden können, da GFP-positive hämatopoetische Zellen eine relativ geringere GFP-Intensität aufwiesen als GFP-positive mesenchymale Zellen (Osteozyten)22.
Die Methoden zur Untersuchung von Osteozyten in vitro haben zu der jüngsten Fülle an Informationen über die Osteozytenbiologie beigetragen. Die Isolierung von Osteozyten ist jedoch nach wie vor ein arbeitsintensives und langwieriges Verfahren mit geringen Zellausbeuten. Die beschriebene Methode des Knochenaufschlusses unter Verwendung von Kollagenase und EDTA, oft bis zur Fraktion 823, dauert mehrere Stunden, in denen die Lebensfähigkeit der Osteozyten beansprucht wird. Forscher haben berichtet, dass Fraktionen (2\u20125) für die Zellsortierung 20 verwendet wurden, und haben gezeigt, dass das Expressionsprofil von Genen, die mit Osteozyten assoziiert sind, im Vergleich zu denen von Osteoblasten den Erfolg der Isolierung reiner Osteozytenpopulationen bestätigt20. In diesem Artikel beschreiben wir den Prozess der Gewinnung von Fraktionen (2\u20125) und vergleichen die Ausbeute an Osteozyten aus jeder Fraktion, beginnend mit Fraktion 1 bis 8, um die Rückgabe von Osteozyten in jeder Fraktion zu bestimmen. Wir beschreiben auch die Präparation von neugeborenen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Schädelstockverdauung mit Kollagenase und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) sowie die Vorbereitung von Zellen für FACS.

<table><tbody><tr><td>BD FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Data aquisition and analysis</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap, 35 &amp;mu;m nylon mesh.</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td>034-22363</td><td>0.2% (w/v), crude collagenase mix sourced from C. histolyticum.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td><td></td><td>5mM EDTA prepared with 0.1% BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Biowest, Nuaill&amp;eacute;, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation buffer</td><td></td><td></td><td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) glucose and 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Millex Sterile Filter Unit</td><td>Merck Millipore, Ireland</td><td>SLGV033RS</td><td>0.22&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Nylon cell strainer</td><td>FALCON, NY, USA</td><td></td><td>40&amp;mu;m</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies, NY, USA</td><td></td><td>0.5% x10. diluted to x1 in PBS</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td></td><td>Containing 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin G, and 100 &amp;mu;g/ml streptomycin</td></tr></tbody></table>

obtaining primary osteocytes through murine calvarial fractionation of gfp-expressing osteocytes

Der Ostezyt, von dem man einst annahm, dass er ein passiver Bewohner des Knochens ist, da er hinter den Kulissen die Funktion hat, mechanische Belastungen zu erfassen, wird nun ins Rampenlicht gerückt und es hat sich gezeigt, dass er mehrere Hauptfunktionen hat, wie z. B. die aktive Modifikation der extrazellulären Matrix und die Bildung eines endokrinen Organs mit dem lakunokanalikulären System, das es umschließt, das Nachrichten an entfernte Orte sendet. Dank der Methoden, die es ermöglichten, den Osteozyten in vitro zu testen, von der Isolierung primärer Osteozyten bis hin zu osteozytenähnlichen Zelllinien, erfahren Osteozyten heute ein durchschlagendes Interesse und einen Wissensschub über Struktur und Funktion. Viele Aspekte der Osteozytenbiologie und der Wechselwirkung mit anderen molekularen Komponenten sind noch nicht entdeckt. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die effiziente Isolierung von primären Osteozyten aus dmp1-topas-neonatalen Mausschäumen, die das grün fluoreszierende Protein in Osteozyten exprimieren, durch Zellfraktionierung und anschließenden Erwerb von Kulturen primärer Osteozyten mittels FACS.

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, den Prozess der Gewinnung von Kulturen primärer Osteozyten aus dmp1-topaz neonatalen Mausschädeln durch einen Fraktionierungsprozess unter Verwendung von Kollagenase zum Abbau der Kollagenmatrix und EDTA für die Calciumchelation zu demonstrieren, wonach die Zellen für FACS vorbereitet werden, um Osteozyten von anderen Zellpopulationen zu trennen.
Methoden zur Gewinnung primärer Osteozyten aus neonatalen Mausschäumen beschreiben häufig die Verwe...

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Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von neonatalen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Isolierung von Osteozyten, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, durch Zellverdau und Fraktionierung sowie die Osteozytenpräparation für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS).

Gewinnung primärer Osteozyten durch murine Schädelstockfraktionierung von GFP-exprimierenden Osteozyten

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

obtaining-primary-osteocytes-through-murine-calvarial-fractionation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

2.1K Aufrufe.  Tohoku University Graduate School of Dentistry. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von neonatalen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Isolierung von Osteozyten, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, durch Zellverdau und Fraktionierung sowie die Osteozytenpräparation für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS).

Serie: Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Medizin

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of therapies to enhance fracture healing.&#160; Periosteal cells rapidly migrate to an injury to supply new chondrocytes and osteoblasts for fracture healing. Traditionally, the efficacy of a cytokine to induce cell migration has only been conducted in vitro by performing a transwell or scratch assay. With advancements in intravital microscopy using multiphoton excitation, it was recently discovered that 1) P-SSCs express the migratory gene CCR5 and 2) treatment with the CCR5 ligand known as CCL5 improves fracture healing and the migration of P-SSCs in response to CCL5. These results have been captured in real-time. Described here is a protocol to visualize P-SSC migration from the calvarial suture skeletal stem cell (SSC) niche towards an injury after treatment with CCL5. The protocol details the construction of a mouse restraint and imaging mount, surgical preparation of the mouse calvaria, induction of a calvaria defect, and acquisition of time-lapse imaging.

This protocol describes the detection of CCL5-mediated periosteal skeletal stem cell migration in real-time using live animal intravital microscopy.

Echtzeit-Bildgebung der CCL5-induzierten Migration von periostalen Skelettstammzellen in Mäusen

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

A Fluorescent Intravital Imaging Approach to Study Load-Induced Calcium Signaling Dynamics in Mouse Osteocytes

Bone tissue is exquisitely sensitive to differences in mechanical load magnitude. Osteocytes, dendritic cells that form a syncytium throughout the bone, are responsible for the mechanosensory function of bone tissue. Studies employing histology, mathematical modeling, cell culture, and ex vivo bone organ cultures have greatly advanced the understanding of osteocyte mechanobiology. However, the fundamental question of how osteocytes respond to and encode mechanical information at the molecular level in vivo is not well understood. Intracellular calcium concentration fluctuations in osteocytes offer a useful target for learning more about acute bone mechanotransduction mechanisms. Here, we report a method for studying osteocyte mechanobiology in vivo, combining a mouse strain with a fluorescently genetically encoded calcium indicator expressed in osteocytes with an in vivo loading and imaging system to directly detect osteocyte calcium levels during loading. This is achieved with a three-point bending device that can deliver well-defined mechanical loads to the third metatarsal of living mice while simultaneously monitoring fluorescently indicated calcium responses of osteocytes using two-photon microscopy. This technique allows for direct in vivo observation of osteocyte calcium signaling events in response to whole bone loading and is useful in the endeavor to reveal mechanisms in osteocyte mechanobiology.

<meta charset="utf8"></head><body>Ein fluoreszierender Intravital-Bildgebungsansatz zur Untersuchung der belastungsinduzierten Kalzium-Signaldynamik in Maus-Osteozyten

The current article describes performing an intravital imaging approach to observe mechanically induced calcium signaling of embedded osteocytes in vivo in real-time in response to tissue-level mechanical loading of the mouse third metatarsal.

Ein fluoreszierender Intravital-Bildgebungsansatz zur Untersuchung der belastungsinduzierten Kalzium-Signaldynamik in Maus-Osteozyten

Bone tissue is exquisitely sensitive to differences in mechanical load magnitude. Osteocytes, dendritic cells that form a syncytium throughout the bone, ...

Biotechnik

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

Anwendung von Retinsäure zu Osteozyten Kulturen aus primären Maus-Osteoblasten erhalten

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

Biologie

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

<meta charset="utf8"></head><body>3D-Modellierung von Osteozyten für die CFD-Analyse zur Untersuchung der Mechanoempfindung im Knochen

Analysis and Imaging of Osteocytes

Osteocytes are the bone cells that are thought to respond to mechanical strains and fluid flow shear stress (FFSS) by activating various biological pathways in a process known as mechanotransduction. Confocal image-derived models of osteocyte networks are a valuable tool for conducting Computational Fluid Dynamics&#160;(CFD) analysis to evaluate shear stresses on the osteocyte membrane, which cannot be determined by direct measurement. Computational modeling using these high-resolution images of the microstructural architecture of bone was used to numerically simulate the mechanical loading exerted on bone and understand the load-induced stimulation of osteocytes.
This study elaborates on the methods to develop 3D single osteocyte models using confocal microscope images of the Lacunar-Canalicular Network&#160;(LCN) to perform CFD analysis utilizing various computational modeling software. Prior to confocal microscopy, the mouse bones are sectioned and stained with Fluorescein isothiocyanate (FITC) dye to label the LCN. At 100x resolution, Z-stack images are collected using a confocal microscope and imported into MIMICS software (3D image-based processing software) to construct a surface model of the LCN and osteocyte-dendritic processes.
These surfaces are then subtracted using a Boolean operation in 3-Matic software (3D data optimization software) to model the lacunar fluidic space around the osteocyte cell body and canalicular space around the dendrites containing lacunocanalicular fluid. 3D volumetric fluid geometry is imported into ANSYS software (simulation software) for CFD analysis. ANSYS CFX (CFD software) is used to apply physiological loading on the bone as fluid pressure, and the wall shear stresses on the osteocytes and dendritic processes are determined. The morphology of the LCN affects the shear stress values sensed by the osteocyte cell membrane and cell processes. Therefore, the details of how confocal image-based models are developed can be valuable in understanding osteocyte mechanosensation and can lay the groundwork for future studies in this area.

<meta charset="utf8"></head><body>Analyse und Bildgebung von Osteozyten

This study outlines the method to visualize and develop three-dimensional (3D) models of osteocytes within the lacunar-canalicular network (LCN) for computational fluid dynamics (CFD) analysis. The generated models using this method help to understand osteocyte mechanosensation in healthy or diseased bones.

Analyse und Bildgebung von Osteozyten

Osteocytes are the bone cells that are thought to respond to mechanical strains and fluid flow shear stress (FFSS) by activating various biological ...

Gewinnung primärer Osteozyten durch murine Schädelstockfraktionierung von GFP-exprimierenden Osteozyten

Zusammenfassung

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Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Sequentiell

Echtzeit-Bildgebung der CCL5-induzierten Migration von periostalen Skelettstammzellen in Mäusen

Ein fluoreszierender Intravital-Bildgebungsansatz zur Untersuchung der belastungsinduzierten Kalzium-Signaldynamik in Maus-Osteozyten

Ein fluoreszierender Intravital-Bildgebungsansatz zur Untersuchung der belastungsinduzierten Kalzium-Signaldynamik in Maus-Osteozyten

Anwendung von Retinsäure zu Osteozyten Kulturen aus primären Maus-Osteoblasten erhalten

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Analyse und Bildgebung von Osteozyten

Analyse und Bildgebung von Osteozyten

Analyse und Bildgebung von Osteozyten