Diese Arbeit wurde durch den National Institutes of Health Grant GM118085 und teilweise durch die Robert Welch Foundation (Grant F-1811 an R.M.H.) unterstützt.

1. Isolierung von Suppressormutanten in motilitätsarmen Stämmen
HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode als umfassenden "Catch-All", um die allgemeine Art des Motilitätsdefekts zu identifizieren.
<ol><li>Soft-Agar-Plattenzubereitung HINWEIS: Weich-Agar, auch als Motilitäts- oder Schwimm-Agar bezeichnet, ist ein Agar mit niedrigem Prozentsatz (~ 0,2-0,35% w / v), das seit langem zur Untersuchung von Chemotaxis31,32verwendet wird.<ol>
<li>3 g Bacto-Agar (0,3% w/v) und 20 g LB in einen 2 L Rundkolben geben. 1 L ddH2O (doppelt destilliertes Wasser) in denKolbengeben und die Suspension mit einem Rührstab und einer magnetischen Rührplatte gleichmäßig mischen.</li>
		<li>Autoklav für 20 min bei 121 °C.</li>
		<li>Mit der Stange/Platte wie oben beschrieben mit sanftem Rühren abkühlen lassen. Wenn die Temperatur etwa 50 °C erreicht, gießen Sie 25 ml in sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm) und lassen Sie das geschmolzene Agar mindestens 1 h lang mit Deckel einstellen, um es innerhalb von 16 h zu verwenden.</li>
	</ol></li>
	<li>Kulturvorbereitung, Impfung und Isolierung von Suppressormutanten HINWEIS: E. coli, die in der Mitte nährstoffreicher Medien geimpft sind, die mit weichem Agar verfestigt sind, verbrauchen Nährstoffe lokal und erzeugen einen Nährstoffgradienten, dem sie folgen. Wenn sie sich nach außen bewegen, erscheinen definierte "Ringe" (Abbildung 1A), die mit bestimmten Chemoattraktantien verwandt sind, auf die die Bakterien reagieren. Defekte im Chemotaxis-System oder in strukturellen Komponenten des Flagellenmotors können die Leistung in diesem Assay beeinträchtigen. Oft entstehen Mutanten mit einem Motilitätsvorteil während des Screenings und können von einzelnen oder von mehreren Punkten entlang der Peripherie des Rings gesehen werden, von wo aus sie "ausflackern"(Abbildung 1C). Man wird feststellen, dass der äußerste Rand der Schwimmfront leicht mit dem unbesiellten jungfräulichen weichen Agar kontrastiert.<ol>
<li>Über Nacht Kulturen des gewünschten motilitätsarmen Stammes in 5 ml Lennoxbrühe (LB; 10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt und 5 g/L NaCl, Materialtabelle)bei horizontalem Schütteln (220 U/a.m) züchten. Am folgenden Tag Subkultur (1:100 Verdünnung) in frischer LB, unter den gleichen Bedingungen bis zur exponentiellen Phase (OD600 von 0,6) wachsend.</li>
		<li>6 μL der Kultur werden mit einer Pipette in die Mitte einer Soft-Agar-Platte (1.1) geimpft und die beladene sterile Spitze in das Agar gedrückt, um den Inhalt vorsichtig auszustoßen. Übergabe auf 30 °C und Inkubation (Abbildung 1B), bis Motilitäts-"Fackeln" sichtbar sind, die vom Impfpunkt oder der Peripherie der Motilitätsringe ausgehen, typischerweise in 24-36 h (Abbildung 1C). HINWEIS: Bei Motilitätstests wird ein Wildtypstamm neben den mutierten Isolaten zum Vergleich geimpft. Dieser Wildtyp-Stamm zeigt die charakteristischen konzentrischen chemotaktischen Ringe (Abbildung 1A) und füllt die Platte innerhalb von 8-10 h.</li>
		<li>Verwenden Sie eine sterile Drahtschlaufe, um die Zellen aus der "Flare" -Region zu heben und einzelne Kolonien auf eine LB-Hartagarplatte zu reinigen (LB wie oben vorbereitet, erstarrt mit 15 g / L Bacto-Agar).</li>
		<li>Wählen Sie einzelne Kolonien mit einer sterilen Drahtschlaufe aus der Streifenplatte und reinigen Sie sie erneut, indem Sie für einzelne Kolonien streifen, um die Isolierung eines "reinen" Kolonieisolats zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestätigung und Charakterisierung von Suppressormutanten
	<ol>
<li>Vergewissern Sie sich, dass die isolierte(n) Suppressormutante(n) die Motilität wiederhergestellt haben. Bereiten Sie Weichagarplatten (1.1) und Kulturen für interessante Stämme (wie in 1.2.1) vor, einschließlich Wildtyp und des beginnenden "Motilitätsmangel"-Stammes zum Vergleich.</li>
		<li>Die Platten impfen (wie in 1.2.2) und bei 30 °C für 8-10 h inkubieren.</li>
		<li>Zeichnen Sie den Durchmesser des äußersten Rings (Rand des Kreises) auf und vergleichen Sie, um festzustellen, welche der Isolate die Motilität im Wesentlichen wiederhergestellt haben. HINWEIS: Es wird empfohlen, Platten während des gesamten Zeitraums des Experiments zu fotografieren. Für beste Ergebnisse verwenden Sie ein "Eimer Licht" Gerät30, wo eine Digitalkamera über einer Lichtquelle für eine bessere Beleuchtung montiert ist, um den Durchmesser der Schwimmkolonie zu messen und sie von unkolonisiertem Agar zu unterscheiden.</li>
		<li>Die Probanden verifizierten Isolate für WGS nach Bedarf, was eine ausreichende "Sequenzabdeckung" ermöglicht, um die Mutationen, die die Wildtypfunktion wiederherstellten, positiv zu identifizieren.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Quantifizierung des motorischen Verhaltens von Flagellen durch Zellanbindeung
HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode, wenn das normale Run-Tumble-Verhalten (Chemotaxis) beeinträchtigt zu sein scheint.
<ol><li>
Kulturvorbereitung und Flagellenscherung
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine exponentielle Phasenkultur des interessierenden Stammes vor, wie in Schritt 1.2.1 beschrieben.</li>
		<li>Pellet 10 mL Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 3 min vor dem Wiederauffüllen in 10 mL filtersterilisiertem Motilitätspuffer (MB; 10 mM Kaliumphosphatpuffer [0,0935 MK2HPO4,0,0065 M KH2PO4, pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). HINWEIS: MB unterstützt die Motilität, aber nicht das Bakterienwachstum</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 noch zwei weitere Male, bevor Sie das endgültige Pellet in 1 ml MB erneut verwenden.</li>
		<li>Die Zellsuspension in eine 1-ml-Spritze überführen und am Ende eine 23G-Nadel befestigen. Stellen Sie eine identische Spritze / Nadelvorrichtung zusammen und befestigen Sie die beiden zusammen über 6 Zoll Polyethylenschlauch (Innendurchmesser von 0,58 mm), der fest über jeder Nadelspitze ummantelt ist.</li>
		<li>Scheren Sie die Flagellen (sie sind zerbrechlich und brechen leicht), indem Sie die Zellsuspension sanft von einer Spritze zur anderen 50x hin und her geben, mit 1 Min. Pausen zwischen 10 Durchgängen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die scherten Zellen bei 2.000 x g für 3 min und resuspendieren Sie in einem Endvolumen von 500 μL MB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diavorbereitung und Zellanbindeung
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Zellfixierkammer vor, indem Sie einen 18 mm x 18 mm abdeckungsartigen Abdeckr über einen 3 Zoll x 1 Zoll x 1 mm Glasmikroskopobjektträger stapeln, der durch doppelseitiges Klebeband getrennt ist (Abbildung S1).</li>
		<li>Spülen Sie die Kammer mit 0,01% (w/v) Polylysinlösung, indem Sie sie auf die Oberseite der Kammer auftragen. Neigen Sie den unteren Rand (den Abdeckrbündchen bündig mit dem Objektträger) auf einen Taskwischer (Seidenpapier), um die Lösung durch die Kammer zu ziehen (Abbildung S1). Dann bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Kammer dreimal mit 40 μL MB wie in Schritt 2.2.2 beschrieben</li>
		<li>40 μL der scherten Zellsuspension (oben vorbereitet) an die Oberseite der Kammer geben und bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren, damit sich die Zellen am Abdeckr anheften können.</li>
		<li>Spülen Sie die Kammer vorsichtig mit 40 μL MB wie in 2.2.3, um nicht befestigte Zellen zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aufzeichnung und Quantifizierung der Zellrotation
	<ol>
<li>Übertragen Sie den mit angebundenen Zellen beladenen Objektträger in den Mikroskopstand.</li>
		<li>Scannen Sie die Population mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie und eines 100-fachen Objektivs nach Zellen, die an Ort und Stelle fixiert sind und sich um eine einzige Achse drehen, d. H. Glatte Rotationen an einem festen Punkt, anstatt sich in einem Winkel zu präsentieren, in dem sich die Zelle in und aus dem Fokus bewegt (Video 1).</li>
		<li>Verwenden Sie ein handelsübliches Mikroskop und die zugehörige Kamera. Öffnen Sie die zugehörige Software, stellen Sie sicher, dass die interessierendsten Zellen im Fokus sind, und klicken Sie auf die Videoaufnahme, um die Zellrotation für eine Minute (bei 10 Bildern pro Sekunde oder höher) aufzuzeichnen.</li>
		<li>Quantifizieren Sie bei der Videowiedergabe die Anzahl der vollständigen Umdrehungen pro Minute und die Häufigkeit, mit der die Zelle die Richtung ändert (Schaltfrequenz). HINWEIS: Rotationsgeschwindigkeiten und Schaltfrequenzen können zu schnell sein, um mit dem Auge gemessen zu werden, daher wird empfohlen, Videosoftware zu verwenden, die eine langsame / feine Wiedergabe bietet, oder ein automatisiertes Softwaresystem zur Quantifizierung von Rotationsmusternverwendet 33. Eine Alternative wäre, die Viskosität des MB mit Methylcellulose (oder einem ähnlichen Mittel) zu erhöhen, um die Rotation schnellerer Bakterien zu verlangsamen und aufzulösen oder zu kompensieren, wenn Kameras mit niedrigen Bildraten verwendet werden.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 mit biologischen Replikaten, um eine Darstellung der interessierenden Population zu erstellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung von Schwärmen in einem grenzüberschreitenden Assay
HINWEIS: Verwenden Sie diese Methode, um die Auswirkungen einer Mutation oder eines Zustands auf die Gruppenmotilität zu bewerten. Schwarm-Agar bezieht sich auf Agar, bei dem der Prozentsatz typischerweise höher ist als der von Weichem Agar. Bei weichem Agar (0,3 %) schwimmen die Zellen einzeln im Inneren des Agars. Bei Schwarmagar (0,5% und mehr) bewegen sich Zellen als Gruppe auf der Oberfläche. Während Schwarmplatten wie hier beschrieben verwendet werden müssen, haben Schwimmplatten eine längere Haltbarkeit und können mehrere Tage verwendet werden. Unsere persönliche Präferenz ist es, in 1-2 Tagen zu verwenden.
<ol><li>
Zubereitung von Schwarmagar
	<ol>
<li>5 g Eiken-Agar (0,5 % w/v) und 20 g LB in einen 2-L-Rundkolben geben. 1 L ddH 2 O in denKolbengeben und die Suspension mit Rührstab und magnetischer Rührplatte gleichmäßig mischen.</li>
		<li>Autoklav für 20 min bei 121 °C.</li>
		<li>Mit sanftem Rühren abkühlen lassen, um Luftblasen mit der Stange / Platte wie oben beschrieben zu vermeiden. Bei ca. 50 °C filtersterilisierte Glukose für eine Endkonzentration von 0,5 % hinzufügen.</li>
		<li>25 ml in sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm) gießen und mindestens 14 h und nicht mehr als 20 h auf Raumtemperatur einstellen lassen. Nicht für die zukünftige Verwendung aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impfung und Inkubation von Schwarmplatten
	<ol>
<li>Impfen Sie 6 μL einer mittel exponentiellen Kultur (vorbereitet wie in 1.2), indem Sie auf dem Agar aufflecken.</li>
		<li>Lassen Sie den Deckel für 5-10 min ab und ersetzen Sie ihn, wenn das Inokum in die Agaroberfläche getrocknet ist.</li>
		<li>Bei 30 °C für 8 h inkubieren. Vermeiden Sie die Versuchung, den Schwarmfortschritt zu überprüfen, indem Sie den Deckel entfernen, da dies zum Trocknen des Agars beiträgt und das Schwärmen beeinträchtigt. HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Stammphänotyp variieren. Einige isolierte Mutationen können die Schwarmfähigkeit beeinträchtigen und erfordern einen reduzierten Prozentsatz an Agar oder eine längere Inkubationszeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Erstellung von grenzüberschreitenden Assay-Platten HINWEIS: Dieser Assay verwendet eine modifizierte Petrischale, bei der eine Kunststoffscheide (Grenze) zwei Kammern anstelle einer erzeugt(Abbildung 2A). Jede Kammer kann unabhängig von der anderen vorbereitet werden und bietet unterschiedliche Bedingungen für das Schwärmen, bevor die beiden "verbunden" werden. Je nach experimentellem Design kann die erste Kammer (links bezeichnet) entweder mit Schwimmagar (0,3% w/v) oder Schwarmagar (0,5% w/v) vorbereitet werden, von wo aus die Bakterien über die Grenze in die rechte Kammer wandern können, die Schwarmagar +/- jede erforderliche Ergänzung oder Herausforderung (z. B. Antibiotika) enthält. Die Migration auf beiden Agaren wird typischerweise gemessen / verglichen, indem der breiteste Durchmesser der Bakterienbesiedlung (von Rand zu Rand) vom ursprünglichen Impfpunkt aufgezeichnet wird.<ol>
<li>Bereiten Sie bei Bedarf Schwimmagar wie in 1.1 beschrieben vor.</li>
		<li>Bereiten Sie Schwarmagar wie in 3.1 beschrieben vor.</li>
		<li>Gießen Sie ~ 30 ml Schwarmagar (bei Bedarf mit gewünschter Ergänzung) in die rechte Kammer einer Petrischale mit zwei Fächern (100 mm x 15 mm), bis zu dem Punkt, an dem sie mit dem Kunststoffteiler zwischen den Kammern gleich ist, aber nicht in die linke überläuft (Abbildung 2B).</li>
		<li>Nachdem das Agar ausgehärtet ist, füllen Sie die linke Kammer mit ~ 30 ml Schwimm- oder Schwarmagar, wieder bis zur Kontaktstelle mit der Kunststoffscheide (Abbildung 2C). Bevor es sich festzieht, ziehen Sie das Agar vorsichtig über den Rand, um die beiden Seiten mit einer ~ 1 mm hohen Agarbrücke zu verbinden, die sich über die gesamte Länge der Trennlinie erstreckt (Abbildung 2D).</li>
		<li>Die Platte bei Raumtemperatur (3.1) trocknen lassen. HINWEIS: Eine alternative Methode zur Herstellung einer Brücke besteht darin, das linke Kammeragar trocknen zu lassen und dann langsam ~ 100 μL geschmolzenes Schwarmagar entlang des Kunststoffteilers zu pipetetten, um die beiden Kammern zu überbrücken (3.4). Impfen Sie die Platten in der linken Kammer wie oben beschrieben für Schwimm- (1.2.2) oder Schwarm-Agar (3.2), bevor Sie bei 30 °C für 12-16 h inkubieren oder bis die Schwärme über der rechten Kammer ausreichende Fortschritte gemacht haben, um Vergleiche zwischen interessierenden Stämmen zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Isolierung und Charakterisierung von Suppressormutationen hat erfolgreich dazu beigetragen, Schlüsselkomponenten des Chemotaxis-Systems35,36,37sowie der Motormaschinen selbst zu identifizieren38,39,40. Bei der Verwendung von Protokoll 1 ist es wichtig, mehrere unabhängige Replikate einzubeziehen, um die Isolierung eines großen Sp...

Bakterien verwenden viele Anhängsel zur Bewegung und Ausbreitung in ihren ökologischenNischen 1. Flagellengetriebene Motilität ist die schnellste von diesen, fördert die Besiedlung günstiger Orte als Reaktion auf Umweltsignale und trägt wesentlich zur pathogenen Fähigkeit einiger Artenbei 2,3. Gegeißelte Bakterien können einzeln in flüssiger Schüttung schwimmen oder als Kollektiv über eine halbfeste Oberflächeschwärmen 4. Extrazelluläre Flagellen haften an und werden von in die Membran eingebetteten Rotationsmotoren angetrieben, die die Kraft der Ionengradienten nutzen, um ein Drehmoment zu erzeugen, das eine Rotation1,2,4,5,6,7,8verursacht . Bei E. coli, deren Motoren mit einem konstanten Drehmoment9laufen , kann die Motorleistung in Bezug auf Drehzahl und Umschaltung des Rotors zwischen gegen den Uhrzeigersinn (CCW) und im Uhrzeigersinn (CW) kategorisiert werden. Die CCW-Rotation fördert die Bildung eines kohärenten Flagellenbündels, das die Zelle vorwärts treibt (Run), während ein transienter Schalter in Rotationsrichtung (CW) dazu führt, dass sich das Bündel entweder teilweise oder vollständig10zerlegt und die Zelle ihre Schwimmrichtung neu ausspricht (Tumble). E. coli laufen typischerweise für eine Sekunde und taumeln für eine Zehntelsekunde. Die Schaltfrequenz des Rotors oder "Tumble Bias" wird durch das Chemotaxis-Signalsystem gesteuert, wobei Transmembran-Chemorezeptoren externe chemische Signale erkennen und über Phosphorelay an den Flagellenmotor übertragen, um Läufe als Reaktion auf Lockstoffe zu verlängern oder sie als Reaktion auf toxische Chemikalien zu unterdrücken11,12. Die Schwimmmotilität wird in 0,3% weichem Agar untersucht.
Während des Schwärmens navigieren Bakterien auf einer halbfesten Oberfläche als dichtes Kollektiv, wo Bakterienpackungen in einer kontinuierlichen Wirbelbewegungströmen 2,13,14,15. E. coli-Schwärme zeigen eine veränderte chemosensorische Physiologie (niedrigere Tumble-Bias), höhere Geschwindigkeiten und eine höhere Toleranz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen über Zellen, die in flüssiger Schüttung schwimmen16,17. Schwärme unterscheiden sich in der Anwendung einer Vielzahl von Strategien, die die Bewegung unterstützen, einschließlich Tensidproduktion, Hyperflagellation und Zelldehnung2. Schwärmen bietet Bakterien einen Wettbewerbsvorteil sowohl im ökologischen als auch im klinischen Umfeld18,19,20. Es gibt zwei Kategorien von Schwarmbakterien: gemäßigte Schwärme, die nur auf Medien schwärmen können, die mit 0,5-0,8% Agar erstarrt sind, und robuste Schwärmer, die über höhere Agarkonzentrationen navigieren können21.
Es gibt eine Vielzahl von Assays, um die Schwimmmotilität und ihre Regulierung zu untersuchen. Wenn sie durch Mutationen oder Umweltbedingungen beeinträchtigt wird, bietet die Motilität selbst eine starke Auswahl für die Identifizierung von Gain-of-Function-Suppressor-Mutationen. Diese Suppressoren können echte Revertanten der ursprünglichen Mutation oder Pseudo-Revertanten sein, bei denen eine zweite Mutation die Funktionalität wiederherstellt. Solche Mutanten können durch Whole Genome Sequencing (WGS) identifiziert werden. Eine Alternative zur unvoreingenommenen Suppressorauswahl ist eine verzerrte gezielte Mutagenesestrategie (z. B. PCR-Mutagenese). Diese Methoden beleuchten oft die Funktion oder Umweltregulation des Motilitätsapparates. Wenn das Ziel darin besteht, die motorische Funktion zu untersuchen, bedeutet die Wiederherstellung der Wildtyp-Motilität, wie sie in weichem Agar gemessen wird, nicht unbedingt auf die Wiederherstellung der Wildtyp-Motorleistung. Der Cell-Tethering-Assay, bei dem Zellen durch ein einzelnes Flagellum an einer Glasoberfläche befestigt werden und anschließend die Rotation des Zellkörpers überwacht wird, kann der erste Assay der Wahl zur Beurteilung des motorischen Verhaltens sein. Obwohl heute ausgefeiltere Methoden zur Überwachung der Motoreigenschaften zur Verfügung stehen, begrenzen die erforderliche Einrichtung von Hochgeschwindigkeitskameras und die Anwendung von Softwarepaketen für die Bewegungsanalyse ihre weit verbreitete Verwendung22,23,24,25. Der Zell-Tethering-Assay erfordert nur, dass die Flagellen geschert werden, so dass die kurzen Filamente an einem Glasobjektträger anhaften, gefolgt von einer Videoaufzeichnung der Rotation des Zellkörpers. Obwohl die aufgezeichneten Motordrehzahlen in diesem Assay aufgrund der hohen Belastung, die der Zellkörper auf das Flagellum ausübt, niedrig sind, hat dieser Assay dennoch zu wertvollen Erkenntnissen über chemotaktische Reaktionen26,27,28,29beigetragen und bleibt ein gültiges Untersuchungsinstrument, wie unten beschrieben.
Die Schwarmmotilität stellt Forscher vor andere Herausforderungen. Die Auswahl von Gain-of-Function-Suppressoren funktioniert nur in Schwärmen, die reichlich Tenside produzieren und leichtschwärmen 13. Tensid-Nichtproduzenten wie E. coli sind anspruchsvoll in Bezug auf die Wahl des Agars, die Medienzusammensetzung und die Feuchtigkeit der Umgebung2,13,14,21. Sobald die Schwarmbedingungen festgelegt sind, ist der Grenzübergangsassay17 eine nützliche Methode, um die Fähigkeit eines Schwarms zu untersuchen, sich unter neuen/rauen Bedingungen zurechtzufinden. Obwohl sich die unten vorgestellten Protokolle auf E. colibeziehen, können sie leicht für die Anwendung bei anderen Arten angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential for E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Or equivalent software for microscope used</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For soft-agar assays</td></tr><tr><td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>For border-crossing assays</td></tr><tr><td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue wipes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Or equivalent single use tissue wipes</td></tr><tr><td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Or equivalent microscope camera</td></tr></tbody></table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

Die Motilität ist entscheidend für das Überleben und den Erfolg vieler Bakterienarten. Es gibt viele Methoden, um die Motilität zu nutzen, um Signalwege zu verstehen, die Funktion und den Aufbau von Flagellenteilen aufzuklären und Bewegungsmuster zu untersuchen und zu verstehen. Hier demonstrieren wir eine Kombination von drei dieser Methoden. Die Motilität in weichem Agar ist die älteste und bietet eine starke Auswahl für die Isolierung von Gain-of-Function-Suppressor-Mutationen in motilitätseingeschränkten Stämmen, bei denen die Motilität durch eine zweite Mutation wiederhergestellt wird. Die Zellanbindetechnik, die zuerst verwendet wurde, um die rotierende Natur des Flagellenmotors zu demonstrieren, kann verwendet werden, um den Einfluss von Signaleffektoren auf die Motordrehzahl und ihre Fähigkeit, die Drehrichtung zu wechseln, zu bewerten. Der "Grenzübertritts"-Assay ist neuer, bei dem schwimmende Bakterien darauf vorbereitet werden können, sich kollektiv als Schwarm zu bewegen. In Kombination stellen diese Protokolle einen systematischen und leistungsfähigen Ansatz dar, um Komponenten der Motilitätsmaschinerie zu identifizieren und ihre Rolle in verschiedenen Facetten des Schwimmens und Schwärmens zu charakterisieren. Sie können leicht angepasst werden, um die Motilität bei anderen Bakterienarten zu untersuchen.

Die Isolierung von Pseudo-Revertanten in einem E. coli-Stamm, dessen Motilität durch hohe Konzentrationen des Signalmoleküls c-di-GMP beeinträchtigt wird, wurde in neueren Arbeiten aus unserem Labor34detailliert beschrieben. Dieser Stamm (JP1442) wies zwei Mutationen auf:Δ yhjH und ΔycgR. YhjH ist die aktivste Phosphodiesterase, die c-di-GMP in E. coliabbaut. Das Fehlen von YhjH führt zu erhöhten c-di-GMP-Spiegeln und einer Hemmung der Motilität. YcgR is...

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Viele Bakterien verwenden Flagellen-getriebene Motilität, um ihre Umgebung zu navigieren und eine günstige Umgebung sowohl einzeln als auch als Kollektiv zu besiedeln. Demonstriert wird hier die Verwendung von drei etablierten Methoden, die Die Motilität als Selektionswerkzeug nutzen, um Komponenten / Pfade zu identifizieren, die zur Schwimm- und Schwarmmotilität beitragen.

Untersuchung der Flagellen-getriebenen Motilität in Escherichia coli durch Anwendung von drei etablierten Techniken in einer Serie

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K Aufrufe.  The University of Texas at Austin. Viele Bakterien verwenden Flagellen-getriebene Motilität, um ihre Umgebung zu navigieren und eine günstige Umgebung sowohl einzeln als auch als Kollektiv zu besiedeln. Demonstriert wird hier die Verwendung von drei etablierten Methoden, die Die Motilität als Selektionswerkzeug nutzen, um Komponenten / Pfade zu identifizieren, die zur Schwimm- und Schwarmmotilität beitragen.

Serie: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Forschung

Biologie

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

Quantifizierung der Schwarmmotilität bakterieller Oberflächen auf Induktorgradientenplatten

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Biochemie

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

Visualisierung von Twitching Motilität und Charakterisierung der Rolle des<em&gt; Pilg</em&gt; in<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Immunologie und Infektion

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Kontinuierliche Messung des biologischen Rauschens in Escherichia Coli mittels Zeitraffermikroskopie

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Biotechnik

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Biophysikalische Charakterisierung von Flagellenmotors Funktionen

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

Visualisierung der bakteriellen Motilität anhand einer Farbreaktion

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...