JAL wurde durch den NIH-Zuschuss K08EY030923 unterstützt; CMC wurde durch ein K01-Stipendium (5K01AR060169) des NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases und ein Novel Research Grant (637405) der Lupus Research Alliance unterstützt.

Alle Verfahren wurden vom Northwestern University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. C57BL/6-Mäuse wurden in einer Barriereanlage am Center for Comparative Medicine der Northwestern University (Chicago, IL) untergebracht. Alle Tiere wurden in 12/12 h Licht/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.
1. Sammlung von Augengewebe
<ol><li>Opfern Sie 10-12-Wochen-alte C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts mit regulierter Verabreichung von Kohlendioxid, bis die Maus nicht mehr reagiert und nicht mehr einatmet. Führen Sie Zervixdislokation oder eine andere zugelassene sekundäre Methode durch, um Dieeuthanasie zu gewährleisten. HINWEIS: Transkardiale Perfusion kann durchgeführt werden, um zirkulierende Leukozyten zu entfernen, die sich nicht in den Augengeweben befinden. In diesem Experiment reduziert die systemische Perfusion nicht die Anzahl von Mikroglia, Monozyten, Makrophagen oder dendritischen Zellen, die in unbehandelten oder laserbehandelten ganzen Augen nachgewiesen werden. Daher befinden sich die meisten dieser Zelltypen im ophthalmologischen Gewebe und dieser Schritt ist optional.</li>
	<li>Um die Augen zu enukleieren, drücken Sie in der Nähe der Augenhöhle nach unten, während Sie ein Paar gekrümmte Zangen sanft unter das Auge legen, während es aus der Steckdose herausragt. Pinch Zange unter dem Auge geschlossen, ohne das eigentliche Auge zu drücken. Augen aus der umgebenden Bindehaut lösen (siehe vorherige Veröffentlichung)23.</li>
	<li>Ziehen Sie das Auge seitlich, bis der Sehnerv die einzige verbleibende Verbindung ist, um das Auge zu lösen. Der Sehnerv trennt sich oft mit Spannung, aber manchmal ist eine kleine Schere notwendig, um den Sehnerv zu schneiden. Legen Sie das Auge in kalte 1x Hank es Buffered Saline Solution (HBSS) mit Kalzium und Magnesium in 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr.</li>
</ol>2. Verdauung des Augengewebes
<ol><li>Bereiten Sie den Verdauungspuffer vor, der 0,1 mg/ml Verdauungsenzym und 0,2 mg/ml DNase in kalten HBSS enthält. Rekonstituieren Sie zunächst 5 mg Verdauungsenzym in 2 ml sterilem Wasser. Bereiten Sie eine anfängliche Verdünnung von 10 mg/ml DNase in HBSS vor. Pro 10 ml des Verdauungspuffers (ausreichend für 3 Tiere) 9,4 ml kalteHBSS mit 0,4 ml rekonstituiertem Verdauungsenzym und 0,2 ml verdünnter DNase I mischen. HINWEIS: Diese Konzentrationen wurden empirisch über mehrere Experimente bestimmt, um ein optimales Maß an Antikörperfärbung einzelner Zellen zu ermöglichen und gleichzeitig den Zelltod zu reduzieren. Collagenase D wurde als Alternative zum Verdauungsenzym mit reduzierter Zelllebensfähigkeit und verminderter CD45+ Zellen ausprobiert. Weitere Informationen zum iterativen Prozess zur Optimierung der Verdauung finden Sie in der Diskussion.</li>
	<li>Entfernen Sie unter einem Sezierender Mikroskop bei 10-facher Gesamtvergrößerung die verbleibende Bindehaut und den Sehnerv mit feinen Zangen und Federscheren in kalten HBSS.</li>
	<li>Bewegen Sie saubere Augen zu einer trockenen Sezschale oder einem kleinen Wägeboot. Injizieren Sie 0,15-0,20 ml/Auge des Verdauungspuffers über eine Spritze mit 30 G Nadel in die Glaskörperhöhle, nachdem zwei perforierende Wunden im Auge durch die Sehachse und 90° von dieser ersten Wunde entfernt für den Verdauungspufferausgang gemacht wurden.</li>
	<li>Mit Federschere und feinen Zangen mit allen Teilen kleiner als 0,5 mm x 0,5 mm ganze Augen zerkleinern. Dissoziieren Sie Linsengewebe mit stumpfer mechanischer Störung über Zangen, um das Verstopfen von Pipettenspitzen in nachfolgenden Schritten zu verhindern. Für jede Probe, Spülen Zangen und Schere jeweils mit 0,75 ml Verdauungspuffer in kleine Schale. Verwenden Sie für jede Probe ein neues Gericht.</li>
	<li>Übertragen Sie den Inhalt der Schale auf ein Dissoziationsrohr auf Eis mit P1000 Pipette, wobei darauf geachtet wird, dass kein Material in der Pipettenübertragung verloren geht. Spülen Sie die Schale mit zusätzlichen 1,5 ml Verdauungspuffer, wodurch das Gesamtvolumen in Dissoziationsrohr auf 3,25-3,50 ml.</li>
	<li>Legen Sie das Dissoziationsrohr invertiert auf den elektronischen Dissoziator und laufen Sie den Zyklus "m_brain_03_01", bestehend aus 1 min unidirektionaler Drehung bei 200 U/min bei Raumtemperatur, was ein vorinstalliertes Programm ist. Stellen Sie sicher, dass sich das gesamte Gewebe an der Unterseite des Dissoziationsrohrs in Kontakt mit dem Verdauungspuffer und dem Rotor für diesen und alle verbleibenden Schritte befindet.</li>
	<li>Legen Sie das Dissoziationsrohr in den Schüttelinkubator für 30 min bei 200 U/min bei 37 °C.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 ein weiteres Mal. Nach der zweiten 30 min Inkubation führen Sie eine letzte mechanische Verdauung mit elektronischem Dissoziator wie in Schritt 2.6 durch.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 ml Kaltstrompuffer hinzufügen und Rohre auf Eis legen.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Zellsuspension
<ol><li>Um eine einzellige Suspension zu erzeugen, gießen Sie die angehaltene Augenverdauungsreaktion durch einen 40-m-Filter, der auf der Oberseite eines 50 ml konischen Zentrifugenrohrs platziert wird. Mit dem Kolben aus einer 2,5 ml Spritze schieben Sie alle verbleibenden Teile des unverdauten Augengewebes durch den Filter.</li>
	<li>Waschen Sie das Dissoziationsrohr mit 10 ml Flow-Puffer und Spülfilter, bevor Sie den gleichen Kolben verwenden, um wieder unverdaute Augengewebeteile durch den Filter zu leiten.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.2 mit 5 ml Flow-Puffer.</li>
	<li>Waschen Sie das Dissoziationsrohr und den Filter mit einem endgültigen 10 ml Flow-Puffer. HINWEIS: Das Gesamtvolumen des Verdauungs- und Durchflusspuffers beträgt etwa 38-40 ml pro Probe.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Dekant den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Bereiten Sie 1x Lysing-Lösung vor, indem Sie sterilem Wasser eine 10-fache Lysing-Lösung hinzufügen. Brechen Sie das Pellet auf, indem Sie das Rohr gegen ein anderes Rohr streicheln. Um rote Blutkörperchen zu lysieren, fügen Sie 1 ml 1x Lysing-Lösung für 30 s mit Wirbeln bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion mit 20 ml Flow-Puffer.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Dekant den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Dissoziieren Sie das Pellet, indem Sie das Rohr gegen ein anderes Rohr streicheln. Fügen Sie 5 ml kalte 1x HBSS pro Tube hinzu.</li>
	<li>Zentrifugenrohre bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirat Überstand.</li>
</ol>4. Färbung der Zellsuspension für mononukleäre Phagozyten
<ol><li>Bereiten Sie 0,5 ml Lebend/Totfleck pro Probe vor, indem Sie Live/Dead Farbstoff 1:5.000 in kalten HBSS verdünnen.</li>
	<li>Fügen Sie jeder Probe mit einer P1000 Pipette einen Live/Dead-Fleck hinzu, der sich erstellt, um das Pellet vollständig zu trennen. Proben in 1,2 ml Mikrotiterröhren übertragen.</li>
	<li>Nehmen Sie einen kleinen Aliquot (10 L), um Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler zu zählen (siehe 4.4). Inkubieren Sie Proben mit Live/Dead-Färbung für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Zählen Sie Zellen mit Trypan blue, um die Anzahl der lebenden Zellen pro Probe zu bestimmen. HINWEIS: In der Regel enthalten 2 Augen einer 10-12 Wochen alten C57BL/6J-Maus weniger als 2 x 106 lebende Zellen.</li>
	<li>Waschen Sie Proben, indem Sie 400 l kalten Durchflusspuffer hinzufügen. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Resuspend Zellen vollständig in 500 l kalten Flow-Puffer. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Blockieren Sie bis zu 5 x 106 lebende Zellen in 50 l Fc Block (1:50 Verdünnung im kalten Durchflusspuffer der gereinigten Rattenanti-Maus-CD16/CD32). Wenn mehr als 5 x 106 lebende Zellen, erhöhen Volumen angemessen.</li>
	<li>Fügen Sie dem Pellet einen Fc-Block hinzu, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig getrennt wird. 20 min bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 50 l Antikörper-Färbelösung (siehe Tabelle 1 zur Auswahl und Menge jedes Antikörpers, der in der Lösung enthalten ist) pro 5 x 106 lebenden Zellen direkt zu den Zellen in Fc Block hinzufügen und vollständig mischen. 30 min bei 4 °C inkubieren. HINWEIS: Antikörpermengen sind abhängig von der Durchflusszytometerkonfiguration und sollten für jedes Labor und Instrument unabhängig getitriert werden. Siehe Tabelle 2 für die Instrumentenkonfiguration von Filtern und Spiegeln. Um Antikörper zu tittieren, beginnen Sie mit der Empfehlung des Herstellers und berechnen Sie den Färbeindex. Führen Sie einen Testlauf mit unterschiedlichen Antikörperkonzentrationen (sowohl oberhalb als auch unterhalb der Empfehlung des Herstellers) durch und wählen Sie die niedrigste Antikörperkonzentration, bei der der Färbeindex beibehalten wird. Stellen Sie außerdem sicher, dass die positive Färbung weniger hell ist als die einfarbige Steuerung. Verwenden Sie ungefärbte Zellen, um sicherzustellen, dass negativ gefärbte Zellen auf einer Skala sind und einen Spitzenwert von 1 x 102haben. Verwenden Sie eine Fluoreszenz minus ein Steuerelement, um die positiv gefärbten Zellen zu definieren.</li>
	<li>Waschen Sie Proben, indem Sie 700 l kalten Durchflusspuffer hinzufügen. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Optional können die Proben nach der Antikörperfärbung mit 500 l Paraformaldehyd im Durchflusspuffer fixiert werden. Proben für 15 min bei Raumtemperatur fixieren. Führen Sie dann eine Wäsche durch, wie in 4.10 beschrieben. Feste Proben bei 4 °C lagern. Zählperlen sollten am Tag der Datenerfassung der Durchflusszytometrie hinzugefügt werden. Feste Proben sollten auf durchflusszytometer in 1-2 Tagen laufen. VORSICHT: Paraformaldehyd ist ein korrosives und gesundheitsgefährdendes Mittel.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben erneut mit 500 l kaltem Durchflusspuffer. Zentrifugenrohre in einem Mikrotiterrohrgestell bei 400 x g für 10 min bei 4 °C. Die Hälfte des Überstandes aspirieren, ohne das Zellpellet zu stören.</li>
	<li>Pellets aufsetzen und auf eine 96-Gut,U-Boden-Assayplatte übertragen. Zentrifugenplatte bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Um den Überstand zu dekantatigen, drehen Sie die Platte um und in einem starken Shake lösen Sie die Flüssigkeit in ein Waschbecken, ohne Pellet zu stören.</li>
	<li>In einem neuen 1,2 ml Mikrotiterrohr 50 l gut wirbelnde Zählperlen platzieren.</li>
	<li>Pellets in 96 Brunnenplatten in 200 l Kaltflusspuffer resuspendieren. Fügen Sie Zellmischung auf der Oberseite der Perlen aus dem vorherigen Schritt. Laufen Sie auf Durchflusszytometer in einem Gesamtvolumen von 250 L / Mikro-Titer-Rohr.</li>
</ol>5. Erfassung von Flusszytometriedaten
<ol><li>Schalten Sie das Durchflusszytometer ein und bereiten Sie es vor. Hier aufgeführte Anweisungen sind für ein modifiziertes Vierlaserzytometer (Tabelle 2).</li>
	<li>Führen Sie eine Testprobe aus, die einen kleinen Aliquot aus jeder Probe enthält, um sicherzustellen, dass alle Zellen für jeden Detektor skaliert werden. Passen Sie die Spannungen so an, dass alle Zellen skaliert sind.</li>
	<li>Führen Sie Single Color Controls (SCC) für jedes Fluorophor aus, das in Derfärbecocktails verwendet wird (Tabelle 3). Legen Sie Mikrotiterrohr in ein größeres 5 ml Polystyrolrohr für die Platzierung auf der Durchflusszytometer-Stufe. HINWEIS: Wurzelfluorophore wie BV421 (Pacific Blue), FITC, PE, Alexa647 (APC) und Alexa700 benötigen nicht den gleichen Antikörper wie der Cocktail (d. h. CD19 PE für CD64 PE). Tandem-Fluorophore wie PE-CF594, PE-Cy7 oder APC-Cy7 benötigen jedoch aufgrund einer möglichen Dissoziation der konjugierten Fluorophore denselben Antikörper für SCC wie Cocktail.<ol>
<li>Erstellen Sie den SCC für BV421, indem Sie 2 Tropfen Kompensationsperlen zu einem 1,2 ml Titerrohr zusammen mit 1 L Hamster-Anti-Maus-CD11c BV421 hinzufügen. Kompensationsperlen werden verwendet, da CD11c BV421 ein IgG-Lambda-Subtyp und nicht Kappa ist, wie in 5.3.3 beschrieben. 15 Min. bei 4 °C inkubieren. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.</li>
		<li>Erstellen Sie den SCC für den Live/Dead Farbstoff, indem Sie einen Tropfen positiver Färbeperlen (grüne Kappe) aus den amin-reaktiven Perlen hinzufügen, gefolgt von 1 L Live/Dead Farbstoff. 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Fügen Sie einen Tropfen der negativen Perlen (weiße Kappe) aus der Amin reaktive Perlen. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.</li>
		<li>Erstellen Sie die verbleibenden SCCs, indem Sie einen Tropfen positiver Färbeperlen (grüne Kappe) aus dem Anti-Ratten- und Antihamster-Ig-Kappa-Perlenset hinzufügen, gefolgt von der aufgeführten Antikörpermenge (Tabelle 3) in einem 1,2 ml Titerrohr. 15 min bei 4 °C inkubieren. Fügen Sie einen Tropfen der negativen Perlen (weiße Kappe) aus der Anti-Ratte und Anti-Hamster Ig kappa Perlen-Set. Fügen Sie 0,2 ml Durchflusspuffer hinzu.</li>
		<li>Wirbel alle Perlenmischungen vollständig. ScCs bei 4 °C für bis zu 3 Tage lagern. HINWEIS: Das SCC für fluoreszierende Reportermäuse sind ungefärbte Zellen.</li>
		<li>Legen Sie beim Ausführen von SCCs Spannungen so fest, dass die SCC-Probe einen Spitzenwert hat, der größer ist als jede Fluoreszenz für eine Zelle im selben Detektorkanal. Darüber hinaus sollten Spannungen so eingestellt werden, dass jeder SCC mindestens 0,5 Log-Differenz zwischen dem Histogramm-Peak im Kanal von Interesse im Vergleich zu jedem anderen Kanal hat (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie Beispiele auf "Niedrig" aus, in dem Ereignisse/Sekunden unter 4000 bleiben. Wenn die Durchflussmenge nicht entsprechend gesenkt werden kann, verdünnen Sie Proben mit zusätzlichem Kaltflusspuffer. Zeichnen Sie das hinzugefügte Volumen auf, da dies für die Zählberechnung erforderlich ist (siehe repräsentative Ergebnisse).</li>
	<li>Sammeln Sie mindestens 3 x 106 Ereignisse pro Stichprobe. Dies kann höher sein als die Zellzahl aufgrund von Pigmentgranulat und Schmutz, der als Ereignisse auf Ihrem Zytometer zählt.</li>
	<li>Zeichnen Sie eine Fluoreszenz Minus One (FMO) für jedes Fluorophor außer Live/Dead für eine korrekte Gating-Strategie in Abschnitt 6.4 auf. Ein FMO ist eine Probe, die mit allen Fluorophoren bis auf eine gefärbt wurde.</li>
	<li>Durchflusszytometer gemäß Hersteller- oder Anlagenanweisungen reinigen und herunterfahren.</li>
</ol>6. Anmerkung der Durchflusszytometriedaten
<ol><li>Öffnen Sie ein neues Arbeitsblatt mit Analysesoftware. Importieren Sie FCS-Dateien aus dem Zytometer für alle Proben und einfarbigen Steuerelemente.</li>
	<li>Verwenden Sie SCCs, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen.</li>
	<li>Wenden Sie die Kompensationsmatrix auf Ihre gebeizten Proben und FMOs an.</li>
	<li>Verwenden Sie die FMOs, um positive Färbung zu bestimmen, um Tore zu ziehen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+physiology+in+the+eye.">Macrophage physiology in the eye.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).</li><li>Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Macrophages+Are+Necessary+for+Beta-Adrenergic+Receptor-Driven+Choroidal+Neovascularization+Inhibition.">Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).</li><li>O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Function+Is+Distinct+in+Different+Anatomical+Locations+during+Retinal+Homeostasis+and+Degeneration.">Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration.</a> Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).</li><li>Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+Conversion+During+Inflammation+and+Injury.">Monocyte Conversion During Inflammation and Injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).</li><li>Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+monocytes+and+macrophages+for+the+inflammatory+response+in+acute+liver+injury.">Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury.</a> Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Sutti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+Mediates+the+Development+of+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+during+Hepatic+Inflammation.">CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation.</a> Cells. 8 (9), 1099 (2019).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+Expressing+VEGF+and+Arginase-1+Following+Uptake+of+Damaged+Retinal+Pigment+Epithelium+Suggests+Potential+Mechanism+That+Drives+the+Onset+of+Choroidal+Angiogenesis+in+Mice.">Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice.</a> PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).</li><li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb46+expression+distinguishes+classical+dendritic+cells+and+their+committed+progenitors+from+other+immune+lineages.">Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).</li><li>Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Production+by+CCR2-Dependent+Macrophages+Contributes+to+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization.">VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization.</a> PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).</li><li>Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ocular+dendritic+cells+in+uveitis.">The role of ocular dendritic cells in uveitis.</a> Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina.">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Science Reports. 6, 20636 (2016).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>M&#252;ller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., M&#252;ller, S., Vajkoczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+microglia,+and+not+peripheral+macrophages,+are+the+main+source+of+brain+tumor+mononuclear+cells.">Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells.</a> International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).</li><li>Nozaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+complement+components+C3a+and+C5a+promote+choroidal+neovascularization.">Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).</li><li>Tsutsumi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+role+of+ocular-infiltrating+macrophages+in+the+development+of+choroidal+neovascularization.">The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization.</a> Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).</li><li>Subhi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+CD11b++Monocytes+and+Anti&#8211;Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Injections+in+Treatment+of+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration+and+Polypoidal+Choroidal+Vasculopathy.">Association of CD11b +Monocytes and Anti&#8211;Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy.</a> JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).</li><li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Expression+of+CD46+and+CD59+on+Leukocytes+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration.">Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).</li><li>Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+is+major+stimulator+in+model+of+choroidal+neovascularization.">VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization.">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping.">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).</li><li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus.">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li><li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization.">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models.">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li><li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry.">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die quantitative Analyse mehrerer Zelltypen in einem komplexen Gewebe. In diesem Bericht beschreiben wir die zytometrische Durchflussdetektion mononuklearer Phagozytenpopulationen, einschließlich Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen-Untergruppen, nach Laserverletzungen im Mausauge. Liyanage et al vor kurzem berichtet eine ähnliche Gating-Strategie, um Neutrophile zu erkennen, Eosinophile, Lymphozyten, DCs, Makrophagen, infiltrierende Makrophagen, und Monozy...

Das angeborene Immunsystem umfasst mehrere Zelltypen, die die Komplementaktivierung und Entzündung stimulieren. Angeborene Immunzellen umfassen natürliche Killerzellen (NK) Zellen, Mastzellen, Basophile, Eosinophile, Neutrophile, und mononukleäre Phagozyten. Mononukleare Phagozyten, die aus Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen bestehen, wurden in die Pathophysiologie mehrerer ophthalmologischer Erkrankungen wie Uveitis, diabetische Retinopathie und altersbedingte Makuladegeneration (AMD)1verwickelt. In diesem Protokoll werden wir uns auf die Identifizierung mononuklearer Phagozyten mittels multiparameterr Flusszytometrieanalyse in einem Mausmodell der neovaskulären AMD2konzentrieren. Dieses Protokoll ist anpassungsfähig für Mausmodelle der diabetischen Retinopathie und/oder Uveitis, aber eine umfassendere Augensektion wird aufgrund der systemischen Natur dieser Krankheiten empfohlen.
Mononukleare Phagozyten exprimiert überlappende Zelloberflächenmarker. Langlebige Gewebe-Resident-Makrophagen und Mikroglia stammen aus dem aus dem Dottersack abgeleiteten Erythromyeloid-Vorläufer3, während das Recycling von Makrophagen und dendritischen Zellen sich vom Knochenmark-abgeleiteten makrophagenen dendritischen Zellvorläufer4unterscheidet. Zu den Mauszelloberflächenmarkern, die Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen gemeinsam sind, gehören CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17und der intrazelluläre Marker Iba18. Um diese Herausforderung zu meistern, definiert die transkriptomische Analyse von Makrophagen, Monozyten und dendritischen Zellen aus mehreren Geweben CD64 als makrophagenspezifischen Zelloberflächenmarker6. Makrophagen wurden in der Iris, Der Aderhaut, dem Ziliarkörper und dem Sehnerv in gesunden Augen beschrieben3. Alternativ ist die dendritische Zellidentifikation schwieriger; Die spezifischste Methode der dendritischen Zellidentifikation erfordert eine Schicksalskartierung mit der Zbtb46-GFP-Reportermaus9. Unabhängig von dieser Reporterzeile kann die Expression von CD11c und MHCII in Verbindung mit dem Fehlen von CD64 potenzielle dendritische Zellen6,10identifizieren. Dendritische Zellen wurden in Hornhaut, Bindehaut, Iris und Aderhaut in normalen Augen11identifiziert. Mikroglia sind spezialisierte Makrophagen in der Netzhaut, geschützt durch die Blut-Retina-Barriere, und abgeleitet von Dotter-Sac-Vorläuferzellen12. Dadurch kann die retinale Mikroglia von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen durch ihre düsteren Konzentrationen von CD45-Expression13 und hohen Konzentrationen von Tmem119 unterschieden werden, die als Durchflusszytometrie-Antikörper14erhältlich sind. Bei der Aktivierung von Mikroglia kann CD45 jedoch15 und Tmem119 herunterreguliert sein3, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, was die Komplexität der Mikrogliabiologie demonstriert, und dies ist wahrscheinlich sowohl für AMD als auch für sein Mausmodell relevant. Schließlich können Monozyten in mindestens zwei Subtypen unterteilt werden, darunter klassische und nicht-klassische. Klassische Monozyten zeigen CCR2+Ly6ChighCX3CR1Low Expression, und nicht-klassische Monozyten zeigen CCR2-Ly6ClowCX3CR1High Marker5.
Aufgrund der Notwendigkeit der quantitativen Analyse der Markerexpression, d.h. hoher im Vergleich zu niedrigen/niedrigen Konzentrationen, ist die Multiparameter-Flow-Zytometrie die ideale Methode zur Diskriminierung zwischen Monozyten, Makrophagen, Mikroglia und dendritischen Zellen im Auge und anderen Geweben. Weitere Vorteile sind die Identifizierung von Subpopulationen, die Möglichkeit, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zur Sortierung von Zellpopulationen für transkriptomische oder proteomische Analysen zu verwenden, und Schicksalskartierung. Der Hauptnachteil der Multiparameter-Flow-Zytometrie ist der Mangel an Gewebearchitektur. Dies kann durch die ophthalmologische Dissektion in die verschiedenen okulären Subkompartimente überwunden werden: Hornhaut, Bindehaut, Iris, Linse, Netzhaut und Aderhautsklera-Komplex. Darüber hinaus kann eine bestätigende Immunfluoreszenz-Bildgebung durchgeführt werden, ist jedoch durch die Anzahl der Marker und den Mangel an robuster Quantifizierung begrenzt.
Genomweite Assoziationsstudien haben mehrere Komplementgene mit AMD16verknüpft. Die Komplementaktivierung führt zur Anaphylatoxinproduktion, Zur Rekrutierung von Leukozyten und zu einer daraus resultierenden Entzündung. Bei Komplementrezeptor-Mangelmäusen reduziert die Laserverletzung die mononukleäre Phagozytenrekrutierung und den laserinduzierten choroidalen Neovaskularisationsbereich (CNV)17. In ähnlicher Weise zeigt die C-C-Motiv-Chemokin-Rezeptor-2 (CCR2)-Knockout-Maus, die einen Mangel an Monozytenrekrutierung im Gewebe hat, sowohl eine verringerte mononukleäre Phagozytenrekrutierung als auch den laserinduzierten CNV-Bereich18. Diese Daten verbinden Komplement und mononukleäre Phagozyten mit experimenteller CNV und möglicherweise neovaskulärer AMD. Zur Unterstützung dieser Assoziation werden Komplementrezeptoren bei Patienten mit neovaskulärer AMD19,20. Diese Daten zeigen einen starken Zusammenhang zwischen AMD und mononukleären Phagozyten.
In diesem Manuskript verwenden wir das experimentelle laserinduzierte CNV-Modell, um die mononukleären Phagozytenpopulationen im Mausauge mittels Multiparameter-Flow-Zytometrie zu charakterisieren. Laserinduzierte CNV ist das Standard-Mausmodell der neovaskulären AMD, das die Wirksamkeit der aktuellen ersten linie neovaskulären AMD-Therapie21demonstrierte. Dieses Protokoll beschreibt die Enukleation von Mausaugen, die Augensektion, die Verdauung in eine Einzelzellsuspension, die Antikörperfärbung, die Bestimmung von Laserspannungen mit Einzelfarbsteuerungen und die Gating-Strategie mit Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen. Eine detaillierte Beschreibung des laserinduzierten CNV-Modells finden Sie in einer früheren Publikation22. Mit diesem Protokoll definieren wir Mikroglia, Monozyten, dendritische Zellen und Makrophagenpopulationen. Darüber hinaus werden wir MHCII und CD11c verwenden, um Makrophagen-Teilmengen innerhalb des laserinduzierten CNV-Modells weiter zu definieren.

<table><tbody><tr><td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431031</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conicals</td><td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml syringe</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>30 G needle</td><td>Exel</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>3ml luer lock syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955457</td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conicals</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Amine reactive beads</td><td>ThermoFisher</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Compensation beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Count beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>Digestion enzyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td><td>DC3-420T</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Electronic dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Integra Miltex</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>Flow buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow tubes</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562782</td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead dye</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Lysing solution, 10x solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube and rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipet tips</td><td>eppendorf</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>P20 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipet man</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6C</td><td>BD Biosciences</td><td>561085</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD Biosciences</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr><tr><td>Swinging bucket centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

Das angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle in der okulären Pathophysiologie, einschließlich Uveitis, diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration. Angeborene Immunzellen, insbesondere mononukleäre Phagozyten, exprimieren überlappende Zelloberflächenmarker, was die Identifizierung dieser Populationen zu einer Herausforderung macht. Die Multiparameter-Durchflusszytometrie ermöglicht die gleichzeitige, quantitative Analyse mehrerer Zelloberflächenmarker, um Monozyten, Makrophagen, Mikroglia und dendritische Zellen in Mausaugen zu unterscheiden. Dieses Protokoll beschreibt die Enukleation ganzer Mausaugen, die Augensektion, die Verdauung in eine einzellige Suspension und die Färbung der einzelzelligen Suspension für myeloische Zellmarker. Darüber hinaus erklären wir die richtigen Methoden zur Bestimmung von Spannungen mit Einzelfarbsteuerungen und zur Abgrenzung positiver Tore mit Fluoreszenz minus 1 Steuerung. Die Hauptbeschränkung der Multiparameter-Flow-Zytometrie ist das Fehlen von Gewebearchitektur. Diese Einschränkung kann durch Multiparameter-Flow-Zytometrie einzelner Augenkompartimente oder kostenlose Immunfluoreszenzfärbung überwunden werden. Die Immunfluoreszenz wird jedoch durch den Mangel an quantitativer Analyse und die geringere Anzahl von Fluorophoren auf den meisten Mikroskopen begrenzt. Wir beschreiben den Einsatz multiparametrischer Durchflusszytometrie zur hochquantitativen Analyse mononuklearer Phagozyten in laserinduzierter choroidaler Neovaskularisation. Darüber hinaus kann die Multiparameter-Durchflusszytometrie zur Identifizierung von Makrophagen-Teilmengen, Schicksalskartierung und Zellsortierung für transkriptomische oder proteomische Studien verwendet werden.

Abbildung 1 zeigte unkompensierte Frequenzhistogramme für die SCCs und Zellen für den roten Laser: Alexa647, Alexa700 und APC-Cy7. In Abbildung 1Azeigte die Magentalinie den Peak des SCC für Alexa647, während die Cyanlinie den beabsichtigten Unterschied von 0,5 Log zeigte. Beachten Sie, dass der Gipfel in Alexa700 und APC-Cy7 links (weniger hell) der Cyan-Linie war. Beachten Sie auch, dass sich die Zellen alle links von der Magentalinie befanden. Zellen rech...

Watch this Scientific Journal Video about Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes at JoVE.com

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Verdauung von Ganzmausaugen für multiparameterflow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagozyten

Dieses Protokoll bietet eine Methode, um ganze Augen in eine einzelzellige Suspension zum Zweck der multiparametern Flow-Zytometrie-Analyse zu verdauen, um spezifische mononukleäre phagozytische Populationen zu identifizieren, einschließlich Monozyten, Mikroglia, Makrophagen und dendritischen Zellen.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4.8K Aufrufe.  Northwestern University. Dieses Protokoll bietet eine Methode, um ganze Augen in eine einzelzellige Suspension zum Zweck der multiparametern Flow-Zytometrie-Analyse zu verdauen, um spezifische mononukleäre phagozytische Populationen zu identifizieren, einschließlich Monozyten, Mikroglia, Makrophagen und dendritischen Zellen.

Serie: Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Forschung

Neurowissenschaften

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Immunologie und Infektion

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Retinal Pericytes Visualization Using Tissue-Clearing and Fluorescent Labeling

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

Biochemie

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Mit grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden verbessert Escherichia Coli Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose bewerten

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Measuring Microglial Uptake of Intravitreally-Delivered Fluorescent Particles Using Flow Cytometry

Source: Murinello, S. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54677">Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates flow cytometry for measuring microglial uptake of fluorescent bioparticles after intravitreal delivery in a mouse eye. Flow cytometry detects live cells expressing CD11b and distinguishes phagocytic microglia cells exhibiting green fluorescence from other myeloid cells, including Ly6C-expressing monocytes and Ly6G-expressing neutrophils.

Messung der Mikrogliaaufnahme von intravitreal abgegebenen fluoreszierenden Partikeln mittels Durchflusszytometrie

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Verdauung von Ganzmausaugen für multiparameterflow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagozyten

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion