Wir danken Dr. Yule Liu von der Tsinghua University für die Bereitstellung des PVX-LIC-Vektors. Diese Arbeit wurde von einem Start-up-Fonds der Texas A&M AgriLife Research und dem Hatch Project TEX0-1-9675 des USDA National Institute of Food and Agriculture an JS unterstützt.

1. Wachsen Sie Kartoffelpflanzen.
<ol><li>Vermehrung von In-vitro-Kartoffelpflanzen in Kulturröhrchen (25 x 150 mm) mit Murashige und Skoog (MS) Medien plus Gamborg-Vitamin (MS-Basalsalzmischung, Gamborg-Vitamin, 30 g/L Saccharose, 3,5 g/L Agar, pH = 5,7). Platzieren Sie die Röhren im Wachstumsraum unter 20–22 °C, 16 h Licht/8 h dunkler Photoperiode und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙s1. HINWEIS: Neue Triebe und Wurzeln entwickeln sich normalerweise in 1-2 Wochen aus Pflanzen. Vermehren Sie jeden Monat Pflanzen mit frischen MS / Gamborg-Vitaminmedien.</li>
	<li>Vier Wochen später transplantieren Sie In-vitro-Pflanzen in den Boden und züchten sie in einem Gewächshaus unter 20–22 °C, 16 h Licht/8 h Dunkler Photoperiode und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙s1. HINWEIS: Die Pflanzen mit neu entwickelten Wurzeln und Blättern sind zum Umpflanzen geeignet. Halten Sie die Feuchtigkeit für die frisch umgepflanzten Pflanzen für die ersten 3-4 Tage aufrecht.</li>
</ol>2. Konstruiere die VbMS-Vektoren.
<ol><li>Entwerfen und klonen Sie die kurzen Tandem-TM-Moleküle (STTM, Abbildung 1)22,53 für die interessierende miRNA. HINWEIS: Erfassen Sie miRNA-Sequenzen basierend auf experimentellen Daten oder aus der miRbase-Datenbank54,55,56,57,58,59. Die in dieser Studie verwendete miR166-Sequenz wurde bereits beschrieben60.<ol>
<li>Entwerfen Sie das TM-Modul, indem Sie eine Mismatch-Sequenz, normalerweise 5'-CTA-3', in die reverse Komplementsequenz der miRNA an der Stelle einfügen, die den 10.–11. Nukleotiden der miRNA entspricht. HINWEIS: Zum Beispiel ist die Stu-miR160-Sequenz 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, wobei die 10.–11. Nukleotide fett gedruckt sind. Die umgekehrte Komplementsequenz (in Desoxynukleotiden) ist 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' und die Mismatch-Bulge-Insertionsstelle ist fett dargestellt. Die TM-Molekülsequenz (Desoxynukleotid) sollte 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3' sein.</li>
		<li>Entwurfsprimer für das Klonen des STTM-Fragments (Abbildung 1). Verwenden Sie DNA-Oligonukleotide mit der 48-nt-Spacer-Sequenz als Vorlage für das PCR-Klonen. Der Vorwärtsprimer besteht aus einem LIC1-Linker (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), der Vorwärtssequenz des oben für TM entwickelten Moleküls und der partiellen 5'-Sequenz des 48-nt-Abstandhalters (5'-GTTGTTGTTGTTGTTATGGT-3'). Der Reverse Primer besteht aus einem LIC2-Linker (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), der reversen Komplementsequenz des TM-Moleküls und einem partiellen reversen Komplement zur 3'-Sequenz des 48-nt-Spacers (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3'). HINWEIS: Die 48-nt-Abstandshaltersequenz ist 5'-GTTGTTGTTGTTGTTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAGAAT-3'. Zum Beispiel sollte für STTM-miR160 der Vorwärtsprimer 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3' sein; Der Reverse Primer sollte 5'-gAggAgAagAgCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' lauten (Abbildung 1).</li>
		<li>Amplifizieren Sie das STTM-Fragment in einem Volumen von 50 μL durch PCR unter Verwendung des synthetisierten universellen 48-nt-Abstandhalters als Vorlage und einer High-Fidelity-DNA-Polymerase.<ol>
<li>Richten Sie die PCR-Reaktion ein, indem Sie 0,5 μL jedes Primers (40 μM), 0,5 μL 48-nt-Spacer-Oligo (40 μM), 5 μL 10x PCR-Puffer, 1 μL dNTP-Gemisch (je 10 mM), 0,1 μL High-Fidelity-DNA-Polymerase (10 U/μL) und 43 μL ddH2O auf ein Gesamtvolumen von 50 μL mischen. 94 °C für 3 min, 32 Zyklen von 94 °C für 45 s, 60 °C für 45 s und 72 °C für 60 s.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reinigen Sie das STTM-Fragment durch Ethanolfällung. Zu den PCR-Produkten werden 2,5 Volumen Ethanol und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH = 4,0) gegeben. Kräftig mischen und 10 min bei 14.000 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und spülen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol ab. Trocknen Sie das Pellet und lösen Sie es in 20 μL ddH2O auf. HINWEIS: Verwenden Sie DNA-Elektrophorese, um die Amplifikation der STTM-PCR-Produkte zu überprüfen.</li>
		<li>Die T4-DNA-Polymerase-Reaktion auf Eis durch Mischen von 2,5 μL gereinigtem STTM PCR-Produkt, 0,5 μL 10x T4 DNA-Polymerase-Puffer, 0,05 μL 1 M Dithiothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP, 0,1 μL T4-DNA-Polymerase (3 U/μL) und 1,6 μL ddH2O auf ein Gesamtvolumen von 5 μL mischen. und die Produkte 20 min lang bei 75 °C behandeln, um die T4-DNA-Polymerase zu inaktivieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie das PVX-basierte VbMS-Konstrukt vor.<ol>
<li>Verdauung von 5 μg PVX-LIC-Plasmid38 mit 2,5 μL SmaI (20 U/μL) in einem Volumen von 100 μL.</li>
		<li>Den verdauten PVX-LIC-Produkten wird eine gleiche Menge Phenol:Chloroform:Isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8,0) zugesetzt und kräftig vermischt. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und überführe den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie eine gleiche Menge Chloroform:Isopropanol (24:1) hinzu und wirbeln Sie kräftig. Zentrifuge bei 14.000 x g für 10 min. HINWEIS: Der PVX-LIC-Vektor beherbergt die LIC-Kassette zum Klonen. Die LIC-Kassette des PVX-LIC-Vektors enthält ein ccdB-Gen und ein Chloramphenicol-resistentes Gen und muss im E. coli-Stamm DB3.1 unter Verwendung von LB-Medium, das Kanamycin (50 μg/L) und Chloramphenicol (15 μg/L) enthält, aufrechterhalten/vermehrt werden.</li>
		<li>Den Überstand in ein neues Zentrifugenrohr überführen. 2,5 Volumen Ethanol und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH = 4,0) zugeben und kräftig mischen. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und entferne den Überstand.</li>
		<li>Spülen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und wirbeln Sie es kräftig. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und entferne den Überstand. Trocknen Sie das Pellet und lösen Sie das aufgeschlossene PVX-LIC-Plasmid mit 100 μL ddH2O auf.</li>
		<li>Richten Sie die T4-DNA-Polymerase-Reaktion auf Eis ein, indem Sie 2,5 μL verdaute PVX-LIC-Vektor-DNA, 0,5 μL 10x T4-DNA-Polymerase-Puffer, 0,05 μL 1 M DTT, 0,25 μL 100 mM dTTP und 0,1 μL T4-DNA-Polymerase (3 U/μL) in einem Gesamtvolumen von 5 μL mischen. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 15 min und behandeln Sie die Produkte bei 75 °C für 20 min bis 20 min inaktivieren Sie die T4-DNA-Polymerase.</li>
	</ol></li>
	<li>Klonen Sie die STTM-Sequenz mithilfe einer LIC-Reaktion in den PVX-LIC-Vektor. Mischen Sie die T4 DNA Polymerase-behandelten STTM PCR Produkte (5 μL) und die T4 DNA Polymerase-behandelten PVX-LIC Plasmide (5 μL). 5 min bei 70 °C inkubieren, an einer Rampe von 0,1 °C/s auf 22 °C abkühlen und 30 min mit einer PCR-Maschine bei 22 °C halten. HINWEIS: Verlängern Sie die Inkubationszeit auf über Nacht bei 4 °C, um eine höhere Effizienz des LIC-Klonens zu erreichen.</li>
	<li>5 μL der LIC-Reaktionsprodukte in die E. coli DH5α umwandeln und auf einer LB-Platte mit 50 μg/ml Kanamycin wachsen62,63. Wählen und verifizieren Sie positive Kolonien durch PCR mit den Klonprimern und dem universellen Primer für den PVX-LIC-Vektor, gefolgt von der Sequenzierung.<ol>
<li>Führen Sie eine Kolonie-PCR mit dem Vorwärtsprimer für PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') in Kombination mit dem Reverse Primer für das STTM-Klonen durch, um positive Klone zu identifizieren. Die Größe des PCR-Bandes sollte ~ 300 bp betragen. HINWEIS: Überprüfen Sie die Sequenzen von STTM-Fragmenten anhand der Terminatorzyklussequenzierung64,65.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolieren Sie die PVX-STTM-Plasmide aus den validierten Klonen und wandeln Sie sie in Agrobacterium-Stämme GV3101, GV2260 oder EHA10562,63 um. Verifizieren Sie Agrobacterium-Kolonien durch PCR. HINWEIS: Bestätigen Sie Agrobacterium-Kolonien durch PCR mit dem Forward Primer für PVX-LIC und dem Reverse Primer für das STTM-Klonen.</li>
</ol>3. Führen Sie einen PVX-basierten VbMS-Assay in Kartoffelpflanzen durch.
<ol><li>Verpflanzen Sie 4 Wochen alte In-vitro-Kartoffelpflanzen in den Boden. Die transplantierten Pflanzen werden 3–4 Tage später einem VbMS-Assay unterzogen.</li>
	<li>Impfen Sie Kartoffelpflanzen mit Agrobacterium , das die PVX-STTM-Plasmide enthält. HINWEIS: Für den VbMS-Assay in Kartoffeln werden agrobacterium-vermittelte Infiltration und Zahnstocher-kratzende Inokulation gleichzeitig durchgeführt.<ol>
<li>Picken und impfen Sie positive Transformanten, die PVX-STTM-Vektoren enthalten, in 50 ml flüssige LB mit 50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Rifampicin. Wachsen Sie in einem 28 °C Inkubator bei 220 U / min für 16 h bis OD600 = 1,0.</li>
		<li>Gleichzeitig streifen Sie die positiven Agrobacterium-Kolonien auf mindestens zwei neue LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Rifampicin und wachsen 1 Tag lang bei 28 °C. Fügen Sie den PVX-LIC38,66-Vektor als Kontrolle und PVX-GFP67,68 zur Überwachung der Virusausbreitung hinzu.</li>
		<li>Sammeln Sie die Agrobacterium-Flüssigkultur durch Zentrifugation bei 3.400 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Agrobacterium-Zellen mit einem gleichen Volumen an Infiltrationspuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES und 200 μM Acetosyringon, pH = 5,6) resuspendieren und auf OD600 = 1,0 einstellen. Bei Raumtemperatur 6 h inkubieren.</li>
		<li>Infiltrieren Sie die Agrobacterium-Kultur mit einer 1 ml nadellosen Spritze in die Abaxialseite vollständig expandierter Blätter.<ol>
<li>Drehen und halten Sie ein Blatt mit einer Hand und verwenden Sie dann einen Finger, um die Blattlamina von der adaxialen Seite an der Infiltrationsstelle zu stützen. Halten Sie die Spritze mit der anderen Hand senkrecht zur Blattoberfläche und infiltrieren Sie die Agrobacterium-Kultur in die abaxiale Seite der Lamina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kratzen Sie die Agrobacterium-Kultur von den LB-Platten und kratzen Sie mit einem Zahnstocher an der Stammoberfläche der ersten ein oder zwei Internodien der infiltrierten Kartoffelpflanzen. Kratzen Sie vorsichtig die Epidermis des Stiels. Vermeiden Sie es, durch den Stängel zu stechen, was zu schweren Schäden an den Pflanzen führen kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Züchten Sie die infiltrierten Pflanzen bei 22 °C mit einer Photoperiode von 16 h Licht/8 h Dunkelheit und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙ s1 in einem Gewächshaus. HINWEIS: Phänotypen, die durch miRNA-Silencing verursacht werden, treten normalerweise 2-4 Wochen nach der Aminokulation auf (Abbildung 2, Abbildung 3). Es dauert in der Regel 10-20 Tage, bis der VbMS-Phänotyp nach der Infiltration auftritt. Der VbMS-Phänotyp hängt von den Eigenschaften der spezifischen miRNA- und Zielgene, den Wachstumsbedingungen und den Kartoffelsorten ab.</li>
</ol>4. Führen Sie eine Ausdrucksanalyse durch.
<ol><li>Wenn Phänotypen 2-4 Wochen nach der Aminokulation auftreten, sammeln Sie Gewebe wie Triebe, Blätter, Blüten oder Wurzeln mit Phänotypen aus den VbMS-Pflanzen und Geweben aus den Kontrollpflanzen mit einer Schere. Isolieren Sie die Gesamt-RNAs aus den gesammelten Geweben.</li>
	<li>Überprüfen Sie die RNA-Qualität durch Elektrophorese62,63 und quantifizieren Sie die RNA-Konzentration, indem Sie die OD260-Absorption mit einem Spektralphotometer messen.</li>
	<li>Verwenden Sie stem-loop real-time reverse transcription PCR (RT-PCR), um die miRNA-Expression zu analysieren.<ol>
<li>Entwerfen Sie für bestimmte miRNAs einen Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimer. Stem-Loop-RT-Primer enthalten ein universelles 5'-Backbone und eine 3' 6-nt-Erweiterung einer spezifischen miRNA. Entwerfen Sie ein 5'-Universal-Backbone (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3'), das eine Stamm-Loop-Struktur bildet. (Der Großbuchstabe entspricht einer umgekehrt-wiederholten Sequenz und der Kleinbuchstabe dem Schleifenbereich).</li>
		<li>Ein Teil der 5'-Backbone-Sequenz, die eine Schleife bildet, dient als reverse Primer für die nachfolgende PCR-Amplifikation (fett-kursive Sequenz in der Backbone-Sequenz). Fügen Sie eine 6-nt-Erweiterungssequenz hinzu, die umgekehrt komplementär zum 3'-Ende der miRNA ist, das für den Stem-Loop-Primer von Interesse ist, um Spezifität für die umgekehrte Transkription bereitzustellen (ergänzende Abbildung 1A). HINWEIS: Entwerfen Sie den Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimer, wie von Chen et al.69 und Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72 beschrieben. Zum Beispiel ist der Stem-Loop Reverse Transcription Primer für Stu-miR160 als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3' konzipiert. Der Stem-Loop Reverse Transkription Primer für die Kartoffel miR165/166 Familie ist als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3' konzipiert. (Die fett gedruckten Großbuchstabensequenzen bieten die Spezifität der reversen Transkription für bestimmte miRNAs).</li>
		<li>Richten Sie die Reverse-Transkriptionsreaktion ein, indem Sie 50–200 ng Gesamt-RNA, 1 μL des Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimers (100 μM), 2 μL 10x Puffer, 0,2 μL RNase-Inhibitor (40 U/μL), 0,25 μL dNTPs (je 10 mM) und 1 μL Reverse Transkriptase (200 U/μL) auf Eis mischen. Nukleasefreies ddH2O zu einem Gesamtvolumen von 20 μL hinzufügen.</li>
		<li>Führen Sie eine umgekehrte Transkription mit dem gepulsten reversen Transkriptionsverfahren durch. Inkubieren Sie das Reverse Transkriptionsreaktionsgemisch bei 16 °C für 30 min, führen Sie einen Temperaturzyklus von 30 °C für 30 s, 42 °C für 30 s und 50 °C für 1 s für insgesamt 60 Zyklen durch und inaktivieren Sie die Reverse Transkriptase durch Inkubation bei 85 °C für 5 min.</li>
		<li>Für die Real-Time-PCR-Analyse der miRNA-Expression entwerfen Sie den Forward-Primer basierend auf der miRNA-Sequenz, schließen jedoch keine Sequenzen ein, die sich mit dem oben entworfenen Stem-Loop-Reverse-Transkriptions-Primer überlappen. Fügen Sie den 5' des Vorwärtsprimers eine 3-7-nt-Erweiterung hinzu, um die Länge, die Schmelztemperatur und den GC-Gehalt zu optimieren (ergänzende Abbildung 1). HINWEIS: Der universelle Reverse Primer ist 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Zum Beispiel ist der Stem-Loop Reverse Transkription Primer für Stu-miR160 als 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3' konzipiert. Der Stem-Loop Reverse Transcription Primer für die miR165/166-Familie ist 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Die fett gedruckten Sequenzen dienen als 5'-Erweiterungen zur Primer-Optimierung. Die Stem-Loop-Reverse-Transkriptions-Primer und die Real-Time-PCR-Primer für miRNA können mit dem miRNA Primer Design Tool73 entworfen werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthetisieren Sie cDNAs der Ziel-mRNAs mittels Standard-Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR). Inkubieren Sie das Reverse Transkriptionsreaktionsgemisch bei 37 °C für 60 min und inaktivieren Sie die Reverse Transkriptase durch Erhitzen auf 85 °C für 5 min. HINWEIS: (1) Prognostizieren Sie Ziel-mRNAs mit dem psRNATarget-Programm74, wenn die Ziel-mRNAs nicht bekannt sind. (2) Der universelle Reverse Transcription Primer für mRNA ist ein verankerter Primer 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT</li>
	<li>Richten Sie die real-time PCR-Reaktion sowohl für die miRNA von Interesse als auch für die Ziel-mRNAs ein. Mischen Sie 0,5 μL Template-cDNA, 5 μL 2x real-time PCR-Puffer mit SYBR green, 0,05 μL jedes Forward- und Reverse-Primers (40 μM) und 4,4 μL ddH2O in einem Gesamtvolumen von 5 μL auf Eis.</li>
	<li>Bei 95 °C für 3 min, 40 Zyklen von 95 °C für 3 s und 60 °C für 30 s inkubieren. Führen Sie eine anschließende Schmelzkurvenanalyse wie folgt durch: Inkubieren bei 95 °C für 15 s, Abkühlen auf 60 °C an einer Rampe von 20 °C/s, Halten bei 60 °C für 60 s, Erhitzen auf 95 °C bei einer Rampe von 0,2 °C/s und Halten bei 95 °C für 15 s. Analysieren Sie die Ct-Werte mit den ΔΔCt-Methoden76,77 und zeichnen Sie die Mittelwerte mit Standardfehlern auf. HINWEIS: (1) Die real-time PCR Primer für Ziel-mRNAs können wie beschrieben entworfen werden75. (2) Das Kartoffelpolyubiquitin-10-Gen kann als interne Kontrolle für die Normalisierung in Kartoffeln dienen. Der Vorwärtsprimer für das Kartoffelpolyubiquitin-10-Gen ist 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' und der reverse Primer 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Bei der Real-Time-PCR-Analyse können Kontamination und Primer-Dimer-Bildung zu falsch positiven Ergebnissen führen. Um die unspezifische Amplifikation zu überwachen und die Haftung der Real-Time-PCR-Analyse zu erhöhen, wird empfohlen, Kontrollen ohne Template und Reverse Transkriptase für Real-Time-PCR-Assays einzubeziehen.</li>
</ol>

Wir präsentieren ein PVX-basiertes miRNA-Silencing-System zur Charakterisierung der Funktion von endogenen miRNAs in Kartoffeln durch Integration des STTM-Designs in den PVX-Vektor. Das VbMS-System erwies sich als wirksam bei der Stummschaltung von miRNA165/166 in Kartoffeln, einer hochkonservierten miRNA-Familie über Pflanzenarten hinweg.
Der TM-Ansatz wurde entwickelt, um die Expression von miRNAs auf der Grundlage einer künstlichen miRNA-Zielmimik zu stören, die eine Mismatch-Schleife a...

Pflanzliche microRNAs (miRNAs) werden als 20–24 nukleotidlange, kernkodierte regulatorische RNAs1 charakterisiert und spielen eine grundlegende Rolle in fast jedem Aspekt pflanzenbiologischer Prozesse, einschließlich Wachstum und Entwicklung2,3, Photosynthese und Metabolismus4,5,6,7, Hormonsynthese und Signalisierung8,9, biotische und abiotische Reaktionen10, 11,12,13 und Nährstoff- und Energieregulierung14,15. Die regulatorischen Rollen von pflanzlichen miRNAs sind gut programmiert und werden typischerweise auf posttranskriptionaler Ebene erfüllt, indem die Ziel-mRNAs entweder gespalten oder translational unterdrückt werden.
Enorme Fortschritte wurden bei der Identifizierung, transkriptionellen Profilerstellung und Zielvorhersage von miRNAs in Kartoffeln gemacht16,17,18,19,20,21. Die funktionelle Charakterisierung von miRNAs in Pflanzen, einschließlich Kartoffeln, ist jedoch aufgrund des Mangels an effizienten und hochdurchsatzigen genetischen Ansätzen hinter anderen Organismen zurückgeblieben. Es ist eine Herausforderung, eine funktionelle Analyse einzelner miRNA durch Standard-Loss-of-Function-Analyse durchzuführen, da die meisten miRNAs zu Familien mit erheblicher genetischer Redundanz gehören22. Darüber hinaus kann eine einzelne miRNA mehrere Zielgene kontrollieren23 und mehrere verschiedene miRNAs können denselben molekularen Signalweg gemeinsam modulieren24,25. Diese Eigenschaften machen es schwierig, die Funktion einer bestimmten miRNA oder einer miRNA-Familie zu charakterisieren.
Ein Großteil der funktionalen Analyse von miRNAs stützt sich stark auf Ansatzmöglichkeiten mit Funktionsverstärkung, die offensichtliche Einschränkungen aufweisen. Die künstliche miRNA (amiRNA)-Methode nutzt die endogenen primären Transkripte (pri-miRNAs), um miRNAs auf hohem Niveau zu produzieren, was zu einer Hemmung der Zielgenexpression führt26,27,28,29. Aktivierungsmarkierung und miRNA-Überexpression unter Verwendung eines starken konstitutiven 35S-Promotors führen jedoch häufig zu einer erhöhten Expression von miRNAs, die nicht repräsentativ für In-vivo-Bedingungen sind und daher möglicherweise nicht die endogene Funktion von miRNAs widerspiegeln30. Es wurde ein alternativer Ansatz entwickelt, der die Expression von miRNA-resistenten Formen von Zielgenen beinhaltet, die unreibbare Mutationen in den Bindungs- und/oder Spaltungsstellen enthalten31,32,33. Dieser Ansatz kann jedoch auch zu einer Fehlinterpretation des Phänotyps führen, der vom miRNA-resistenten Zieltransgen aufgrund transgener Artefakte abgeleitet wurde. Daher sollten Schlussfolgerungen aus diesen Untersuchungen zum Funktionsgewinn mit Vorsicht gezogen werden34. Eine weitere große Einschränkung der oben beschriebenen Ansätze besteht darin, dass sie eine Transformation erfordern, die arbeitsintensiv und zeitaufwendig ist. Darüber hinaus sind die transgenabhängigen Ansätze für transform-widerspenstige Pflanzenarten kaum anwendbar. Daher ist es wichtig, einen schnellen und effizienten Loss-of-Function-Ansatz zu entwickeln, um die Funktion von miRNAs zu entschlüsseln.
Um die Voraussetzung des Transformationsverfahrens zu umgehen, wurde ein virusbasiertes microRNA-Silencing (VbMS) etabliert, indem die Target-Mimic-Strategien (TM) mit virus-abgeleiteten Vektoren kombiniert werden. Im VbMS-System werden künstlich konstruierte TM-Moleküle vorübergehend von einem Virus-Backbone exprimiert und bieten ein leistungsfähiges, hochdurchsatzreiches und zeitsparendes Werkzeug, um die Funktion von pflanzlichen endogenen miRNAs zu sezieren35,36. VbMS wurde ursprünglich in N. benthamiana und Tomaten mit dem Tabakrasselvirus (TRV)35,36,37 entwickelt und unter Verwendung verschiedener anderer Virusexpressionssysteme auf Arabidopsis, Baumwolle, Weizen und Mais ausgedehnt, darunter Kartoffelvirus X (PVX)38, Baumwollblattknautschvirus (ClCrV)39, Gurkenmosaikvirus (CMV)40,41,42, Chinesisches Weizenmosaikvirus (CWMV)43 , und Gerstenstreifenmosaikvirus (BSMV)44,45.
Die Kartoffel (Solanum tuberosum) ist die viertwichtigste Nahrungspflanze und die am weitesten verbreitete Noncerealpflanze der Welt, vor allem wegen ihres hohen Nährwerts, ihrer hohen Energieproduktion und ihres relativ geringen Inputbedarfs46. Mehrere Eigenschaften der Kartoffel machen sie zu einer attraktiven zweikeimblättrigen Modellpflanze. Es ist eine vegetativ vermehrte polyploide Pflanze mit hoher Auskreuzungsrate, Heterozygotie und genetischer Vielfalt. Bis heute gibt es jedoch keinen Bericht, der die Funktion von miRNAs in Kartoffeln mit VbMS charakterisiert. Hier stellen wir einen ligationsunabhängigen Klonierungs-(LIC)-angepassten Kartoffel-PVX-basierten VbMS-Ansatz vor, um die Funktion von miRNAs in Kartoffelpflanzen zu bewerten38. Wir haben die miR165/166-Familie ausgewählt, um den VbMS-Assay zu veranschaulichen, da die miR165/166-Familie und ihre Ziel-mRNAs und Transkriptionsfaktoren der Klasse III Homöodomänen/Leu-Reißverschluss (HD-ZIP III) umfassend charakterisiert wurden22,47,48. Die HD-ZIP III-Gene sind Schlüsselregulatoren der Meristementwicklung und Organpolarität, und die Unterdrückung der miR165/166-Funktion führt zu einer erhöhten Expression der HD-ZIP III-Gene, was zu pleotropen Entwicklungsdefekten wie reduzierter apikaler Dominanz und abweichenden Mustern der Blattpolarität führt22,35,38,41 . Die leicht scorablen Entwicklungsphänotypen, die mit dem Silencing von miRNA165/166 korrelieren, ermöglichen eine genaue Bewertung der Wirksamkeit des PVX-basierten VbMS-Assays.
In dieser Studie zeigen wir, dass das PVX-basierte VbMS-System die Funktion von miRNAs in Kartoffeln effektiv blockieren kann. Da das PVX-basierte virusinduzierte Gen-Silencing-System (VIGS) in einer Reihe von Kartoffelsorten etabliert wurde49,50,51,52, kann dieser PVX-basierte VbMS-Ansatz wahrscheinlich auf eine breite Palette von diploiden und tetraploiden Kartoffelarten angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>100 &amp;micro;M dATP and 100 &amp;micro;M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodium acetate, pH 4.0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td><td>#S0297</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene</td></tr><tr><td>E. coli DH5&amp;alpha;</td><td></td><td></td><td>for the destination constructs generated by LIC cloning</td></tr><tr><td>Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,&lt;br/&gt; Wilmington, MA, USA</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Pure Ethanol &amp;ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>Nano-drop spectrometer: NanoDrop One&lt;sup&gt;C&lt;/sup&gt; Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System</td><td>Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td><td>Benchtop pH / mV Meter - 860031</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX VIGS vector: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao et al., 2016</td></tr><tr><td>Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR reagent: KAPA SYBR&amp;reg; FAST qPCR Master Mix (2x) Kit</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,&lt;br/&gt; Wilmington, MA 01887, USA</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>Restriction enzyme: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>SKU: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor Murine</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>Soil: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase and buffer</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

potato virus x-based microrna silencing (vbms) in potato.

Virus-basiertes microRNA-Silencing (VbMS) ist ein schnelles und effizientes Werkzeug zur funktionellen Charakterisierung von microRNAs (miRNAs) in Pflanzen. Das VbMS-System wurde für verschiedene Pflanzenarten entwickelt und angewendet, darunter Nicotiana benthamiana, Tomaten, Arabidopsis, Baumwolle und Monokotyledonen wie Weizen und Mais. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das PVX-basierte VbMS-Vektoren verwendet, um endogene miRNAs in Kartoffeln zum Schweigen zu bringen. Um die Expression einer spezifischen miRNA zu unterdrücken, werden Target-Mimic-Moleküle (TM) von miRNA von Interesse entworfen, in pflanzliche Virusvektoren integriert und in Kartoffeln durch Agrobacterium-Infiltration exprimiert, um direkt an die endogene miRNA von Interesse zu binden und ihre Funktion zu blockieren.

Abbildung 2 zeigt die PVX-STTM165/166 Kartoffelpflanzen (Katahdin) mit ektopischem Wachstum von Blattgeweben von der Abaxialseite der Blattlamina entlang der Venen. Schwerere Phänotypen wie trompetenförmige Blattbildung wurden ebenfalls beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde in den PVX-Kontrollanlagen keine phänotypische Anomalie beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das VbMS-System die endogene miRNA-Funktion in tetraploiden Kartoffelpflanzen wirksam unterdrückte und das PVX-VbMS-Syste...

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Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für das auf Kartoffelvirus X (PVX) basierende microRNA-Silencing-System (VbMS) zur funktionellen Charakterisierung endogener microRNAs (miRNAs) in Kartoffeln. Target Mimic (TM) Moleküle von miRNA von Interesse werden in den PVX-Vektor integriert und vorübergehend in Kartoffeln exprimiert, um die Ziel-miRNA oder miRNA-Familie zum Schweigen zu bringen.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

3.1K Aufrufe.  Texas A&M University System. Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für das auf Kartoffelvirus X (PVX) basierende microRNA-Silencing-System (VbMS) zur funktionellen Charakterisierung endogener microRNAs (miRNAs) in Kartoffeln. Target Mimic (TM) Moleküle von miRNA von Interesse werden in den PVX-Vektor integriert und vorübergehend in Kartoffeln exprimiert, um die Ziel-miRNA oder miRNA-Familie zum Schweigen zu bringen.

Serie: Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Forschung

Biotechnik

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Umwelt

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins with the ability to inhibit the host plant RNA silencing pathway. Unlike virus effector proteins, only several secreted effector proteins have showed the ability to suppress RNA silencing in bacterial, oomycete, and fungal pathogens, and the molecular functions of most effectors remain largely unknown. Here, we describe in detail a slightly modified version of the co-infiltration assay that could serve as a general method for observing RNA silencing and for characterizing effector proteins secreted by plant pathogens. The key steps of the approach are choosing the healthy and fully developed leaves, adjusting the bacteria culture to the appropriate optical density (OD) at 600 nm, and observing green fluorescent protein (GFP) fluorescence at the optimum time on the infiltrated leaves in order to avoid omitting effectors with weak suppression activity. This improved protocol will contribute to rapid, accurate, and extensive screening of RNA silencing suppressors and serve as an excellent starting point for investigating the molecular functions of these proteins.

Here, we present a modified screening method that can be extensively used to quickly screen RNA silencing suppressors in plant pathogens.

Screening und Identifizierung von RNA-Silencing Suppressoren von sezernierten Effektoren von Pflanzenpathogenen

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Genetik

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Immunologie und Infektion

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Biologie

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Biochemie

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

MicroRNA-basierten Regulation der Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

Agroinfiltration und PVX Agroinfektion in Kartoffel und Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the injection of maize seedlings near meristematic tissue with Agrobacterium carrying a viral vector. Recombinant foxtail mosaic virus (FoMV) clones engineered for gene silencing and gene expression were used to optimize this method, and its use was expanded to include a recombinant sugarcane mosaic virus (SCMV) engineered for gene expression. Gene fragments or coding sequences of interest are inserted into a modified, infectious viral genome that has been cloned into the binary T-DNA plasmid vector pCAMBIA1380. The resulting plasmid constructs are transformed into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101. Maize seedlings as young as 4 days old can be injected near the coleoptilar node with bacteria resuspended in MgSO4 solution. During infection with Agrobacterium, the T-DNA carrying the viral genome is transferred to maize cells, allowing for the transcription of the viral RNA genome. As the recombinant virus replicates and systemically spreads throughout the plant, viral symptoms and phenotypic changes resulting from the silencing of the target genes lesion mimic 22 (les22)&#160;or&#160;phytoene desaturase (pds) can be observed on the leaves, or expression of green fluorescent protein (GFP) can be detected upon illumination with UV light or fluorescence microscopy. To detect the virus and assess the integrity of the insert simultaneously, RNA is extracted from the leaves of the injected plant and RT-PCR is conducted using primers flanking the multiple cloning site (MCS) carrying the inserted sequence. This protocol has been used effectively in several maize genotypes and can readily be expanded to other viral vectors, thereby offering an accessible tool for viral vector introduction in maize.

An Agrobacterium-based injection (agroinjection) protocol is presented for the inoculation of foxtail mosaic virus&#160;and sugarcane mosaic virusclones into maize seedlings. Inoculation in this manner leads to viral infection, virus-induced gene silencing of marker genes, and viral overexpression of GFP.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

Zusammenfassung

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