Die Praxis, Pflanzenzurwelt zur Verbesserung der Gesundheit zu verwenden, liegt Tausende von Jahren zurück. In jüngster Zeit hat die gestiegene Nachfrage in Verbindung mit nicht nachhaltigen Erntepraktiken und dem Klimawandel die Lieferkette belastet. Aus diesem Grund wird die botanische Verfälschung zu einem wachsenden Problem, was die botanische Identifizierung zu einem immer wichtigeren Bestandteil der Qualitätskontrolle macht.
Im Idealfall wird die Identifikation so nah wie möglich an der Quelle durchgeführt, sodass Ressourcen effizient dem Material der richtigen Identität zugeordnet werden können. Es gibt eine Reihe von Ansätzen für die botanische Identifizierung. Traditionell wird die botanische Identifizierung durch morphologische Bewertung und chemische Analysemethoden durchgeführt.
Die morphologische Identifikation basiert auf Unterschieden in den makroskopischen und mikroskopischen Merkmalen von Pflanzenmaterialien. Es erfordert jedoch einen gut ausgebildeten Botaniker und seine Anwendung auf pulverförmige botanische Materialien ist begrenzt. Chemische Analysemethoden sind in Arzneibüchern und Laboratorien weit verbreitet, eignen sich aber aufgrund der Größe der Instrumente und der Umweltanforderungen nicht ideal für Feldtests.
In jüngster Zeit haben sich genomische Methoden aufgrund der hohen Genauigkeit und Spezifität genomischer Informationen in Pflanzenmaterialien als alternative Technik zur Identifizierung botanischer Arten herausgebildet. Mit molekulardiagnostischen Werkzeugen, die jetzt in Form von tragbaren Geräten verfügbar sind, wird dieser Ansatz für die Feldanwendung möglich. Ziel dieses Protokolls ist die Einführung einer Methode zur botanischen Identifizierung in Situationen, in denen der Zugang zu den Laborgeräten und dem Fachwissen begrenzt ist, wie z. B. die Farm, die das botanische Material liefert, mit einem tragbaren qPCR-System.
Matricaria chamomilla, allgemein bekannt als deutsche Kamille, wurde als pflanzliches Medikament verwendet, um die Gesundheit seit Jahrhunderten zu fördern. Um die Spezifität der aktuellen Methode zu demonstrieren, wird die Differenzierung der deutschen Kamille von einer anderen häufig verwendeten Kamillenblüte, der römischen Kamille, zum Vergleich einbezogen. Das Feldidentifikationsverfahren wird in der Mitte eines deutschen Kamillenhofes demonstriert.
Richten Sie einen Testbereich im Feld mit einer flachen und horizontalen Fläche ein. Identifizieren Sie eine repräsentative Pflanze, die die Eigenschaften der meisten Pflanzen im Kamillenblütenfeld widerspiegelt. Wählen Sie einen Blütenkopf aus der repräsentativen Pflanze mit sterilen Handschuhen.
Legen Sie die Probe in ein 2,0 Milliliter-Sammelrohr. Wiederholen sie eine etwa 0,5 bis 0,7 Zentimeter lange Packungsbeilage von derselben Pflanze und sammeln Sie sie. Den Trockenbad-Inkubator auf 95 Grad Celsius vorheizen.
Zu jedem Sammelrohr 100 Mikroliter der Extraktionslösung aus dem Pflanzen-DNA-Extraktionskit hinzufügen. Für eine bessere DNA-Extraktionseffizienz, mahlen Sie die Probe mit einem Gewebeschädling. Schließen Sie die Röhre.
Stellen Sie sicher, dass das botanische Gewebe während des gesamten Extraktionsprozesses von der Extraktionslösung abgedeckt wird. Legen Sie die Sammelrohre in einen vorgeheizten Trockenbad-Inkubator und bebrüten die Sammelrohre bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten Nach 10 Minuten nehmen Sie die Schläuche aus dem Trockenbad-Inkubator. Fügen Sie 100 Mikroliter der Verdünnungslösung aus dem DNA-Extraktionskit hinzu und mischen Sie die Lösung, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen.
Wiederholen Sie den gleichen Schritt für die Extraktion von Packungsbeilagen. Schütteln Sie, um die Lösung weiter zu mischen. Das Pflanzenproblem scheint nach dieser Behandlung in der Regel nicht abgebaut zu sein.
Die flüssige Farbe kann sich ändern und trüb werden. Konfigurieren Sie die thermocycling-Bedingungen des qPCR-Instruments gemäß Tabelle 1, die mit einem konstanten Temperaturschritt für die anfängliche Denaturierung beginnt, gefolgt von 25 Zyklen der Verstärkung und endet mit Temperaturramping, um eine hochauflösende Schmelzkurve zu erhalten. Den qPCR-Master-Mix und die Primer, die in Tabelle 2 aufgeführt sind, vor der Verwendung bei Raumtemperatur auftauen.
Planen Sie die Reaktion, die in jedem Brunnen geladen wird. Brunnen mit positiven Kontrollen mit den Zielarten, positive Kontrollen mit Nichtzielarten, Proben und Negativkontrollen. In diesem Beispiel werden 10 Brunnen verwendet, fünf für den deutschen Kamillenidentifikationstest und weitere fünf für den römischen Kamillen-Identifikationstest.
Für jede Art von Artenidentifizierungstest enthält ein Brunnen eine positive Kontrolle mit DNA, die aus dem Zielarten-Referenzmaterial extrahiert wurde, eine Bohrung enthält eine positive Kontrolle mit DNA, die aus nicht zielgerichtetem Arten-Referenzmaterial extrahiert wurde, zwei Brunnen werden mit aus dem Feld extrahierten Blumen- und Blatt-DNA-Proben gefüllt, und ein Brunnen wird für eine negative Kontrolle zugeordnet. Tabelle 3 beschreibt jeden Brunnentyp. Bereiten Sie einen Reaktionsmaster-Mix gemäß Tabelle vier für jeden Botanischen Arten-Identifikationstest vor.
Ein typischer Reaktionsmaster-Mix enthält universellen qPCR-Master-Mix, zwei Mal, vorwärts- und rückwärts artspezifische Primer und nukleasefreies Wasser. Gründlich gemischt die Reaktion Master-Mix durch Pipettieren vor gebrauchen. Legen Sie die PCR-Reaktionspatrone nach oben auf eine flache und stabile Oberfläche.
18 Mikroliter des im vorherigen Schritt konfigurierten Reaktionsmaster-Mixes gemäß den hier definierten Brunnen in die Kartuschenbrunnen laden. Für diese Vorführung fügen Sie den deutschen Kamillen-Identifikationstest-Reaktions-Master-Mix in Brunnen ein, drei, fünf, sieben, sieben, neun und den römischen Kamillen-Identifikationstest-Reaktionsmaster-Mix in Brunnen, die für den RC-Test gekennzeichnet sind, RCT in Denbrunnen zwei, vier, sechs, acht, 10. Übertragen Sie zwei Mikroliter Proben-DNA aus dem Überstand der DNA-Extraktionsröhrchen und vorextrahierten DNA-Positivenkontrollen in Kartuschenbrunnen, die mit qPCR-Master-Mix vorinstalliert sind.
Nachdem Sie jede DNA-Vorlage zum qPCR-Mastermix hinzugefügt haben, mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Pipettieren. Versiegeln Sie die Patrone vorsichtig mit Klebefolie. Legen Sie die Patrone auf die Thermocyclingkammer und schließen Sie sie.
Legen Sie die Ausführung des qPCR-Instruments fest. Im aktuellen Protokoll wird interkalierender Farbstoff verwendet, um die Verstärkung von Zielfragmenten in Echtzeit zu messen. Der Ct-Wert ist definiert als die Anzahl der Zyklen, die erforderlich sind, damit das Fluoreszenzsignal den vordefinierten Schwellenwert überschreitet.
Ein Ct-Wert von weniger als 25 Zyklen wurde als positive Verstärkung betrachtet. In dieser Abbildung wurde die römische Positivkontrolle nur im römischen Kamillenidentifikationstest verstärkt, nicht aber im deutschen Kamillenidentifikationstest. Die deutsche Kamille-Positivkontrolle und Feldproben wurden nur im deutschen Kamillen-Identifikationstest verstärkt, nicht aber im römischen Kamillen-Identifikationstest.
Die Negativkontrolle wurde in beiden Tests nicht verstärkt. Um die spezifische Amplifikation in positiven Kontrollen und Proben weiter zu bestätigen, wurden Fraktionen von PCR und Produkte aus jedem Bohrgut auf 2%Agarose-Gel im Labor ausgeführt. Alle Brunnen mit einem Ct-Wert von weniger als 25 ergaben Amplicons in ihrer erwarteten Größe, die sich zwischen deutscher Kamille und römischer Kamille unterscheiden.
Die übrigen Bahnen wiesen kein spezifisches Amplifikationsprodukt auf, in Übereinstimmung mit dem Fehlen eines Fluoreszenzsignals für diese Brunnen, wie es bei Feldversuchen beobachtet wurde. Nach der PCR-Verstärkung wurde eine Schmelzkurvenanalyse mit derselben Software durchgeführt, die zur Überwachung des Fluoreszenzsignals verwendet wurde. Mit dem Temperaturanstieg beginnen die Doppelstrang-Amplicons zu dissoziieren, was zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität führt.
Die Fluoreszenzintensitätsänderungen wurden weiter in schmelzende Peakkurven umgewandelt, um die deutsche Kamille von der römischen Kamille durch ihre charakteristischen Schmelzspitzen weiter zu differenzieren. In dieser Abbildung beträgt der schmelzende Gipfel der deutschen Kamille-Positivkontrolle 85,6 Grad Celsius und unterscheidet sich von der schmelzenden Spitze der römischen Kamille-Positivkontrolle. Die PCR-Amplicons aus Feldproben erzeugen Schmelzspitzen in der Nähe der deutschen Kamille-Positivkontrolle.
Die Identität der Feldprobe wird anhand einer spezifischen Verstärkung und charakteristischen Schmelztemperatur bestimmt, die den Kontrollen entspricht. In diesem Beispiel werden sowohl Die im Feld gesammelte Blume als auch das Blatt als Matricaria chamomilla, deutsche Kamille, identifiziert. Römische Kamillentestergebnisse für diese beiden Proben sind negativ.
Das Protokoll demonstriert die Identifizierung der deutschen Kamille im Feld mit einem tragbaren qPCR-System. Ähnliche Methoden können wir entwickeln, um das Portfolio an pflanzenähnlichen Stoffen zu erweitern, die getestet werden können. Wir hoffen, dass dieses Video wertvolles Schulungsmaterial für Wissenschaftler, auch für Nicht-Experten, liefern wird, um die botanische Identifizierung vor Ort oder in einer Umgebung mit begrenzter Laborausrüstung durchzuführen.
DNA-basierte Feldidentifikationstests liefern nicht nur hochpräzise Ergebnisse, die mit der Laboranalyse übereinstimmen, sondern reduzieren auch die Zeit und kosten, die mit herkömmlichen Methoden im Labor verbunden sind.
