Das Zusammenspiel von Proteinen und Peptiden mit anorganischem Material ist ein grundlegendes Phänomen mit Auswirkungen auf Nanotechnologie, Biomaterialien und Biotechnologie. Der erste Schritt zum Verständnis eines solchen Phänomens ist die Aufdeckung der grundlegenden physikalisch-chemischen Konstanten wie Adsorptionskonstante, Gibbs freie Energie, Enthalpie, Entropie und begrenzte Adsorption, die durch die Etablierung von Adsorptionsisothermen bewertet werden können. Die Adsorption aus der flüssigen Phase wird jedoch durch Kinetik, Oberflächenkapazität, pH-Wert und vergleichende Adsorption eingeschränkt, die alle vor dem Setzen des Experiments bewusst berücksichtigt werden sollten.
In diesem Video werden meine Kollegen Elena Korina und Sergei Neifert die physikalisch-chemische Studie der Dipeptidadsorption auf Lösungsdispergierung Titandioxid-Abdeckungsfunktionen vorstellen, die helfen, versteckte Risiken zu vermeiden, denen Forscher bei der Durchführung relevanter Experimente ausgesetzt sein können. 183 Milligramm Dipeptid in das sterile polymere Reagenzglas geben und bis zu ca. 35 Milliliter mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen und bei Raumtemperatur unter kräftigem Rühren auflösen. Wenn sich das Dipeptid nicht in doppelt destilliertem Wasser und Unterrühren auflöst, die Dipeptidlösung in das Ultraschallbad geben und einige Minuten beschallen.
Stellen Sie den pH-Wert der vorgelösten Lösung eines Peptids auf 7,4 ein, indem Sie der Dipeptidlösung unter Rühren bei Raumtemperatur vorsichtig eine Lösung von MES oder Natriumhydroxid hinzufügen und den pH-Wert mit einem pH-Meter überwachen. Nach dem Einstellen des pH-Werts die Lösung in den Messzylinder gießen. Spülen Sie das Reagenzglas und füllen Sie den Messzylinder mit dem doppelt destillierten Wasser bis zu 40 Milliliter, um die Endkonzentration von 16 Millimolar zu erreichen.
Bereiten Sie Dipeptid-Verdünnungen mit Konzentrationen zwischen 0,4 und 12 Millimolar vor, indem Sie 16 Millimolar-Dipeptid-Lösung mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Um beispielsweise acht Millimolar-Dipeptid-Lösung vorzubereiten, fügen Sie sieben Milliliter doppelt destilliertes Wasser zu 10 Milliliter 16 Millimolar-Dipeptid-Lösung hinzu. Stellen Sie nach der Verdünnung den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie der Dipeptidlösung eine tropfenweise Lösung von MES oder Natriumhydroxid hinzufügen.
Nach dem Einstellen des pH-Werts die Lösung in den Messzylinder gießen. Spülen Sie das Reagenzglas und füllen Sie den Messzylinder bis zu 20 Milliliter mit doppelt destilliertem Wasser, um eine Konzentration von acht Millimolar zu machen. Andere Verdünnungen der Dipeptid-Stammlösung werden entsprechend vorbereitet.
Am Ende erhalten wir eine Reihe von Dipeptid-Verdünnungen bereit für Adsorptionsstudien. Bereiten Sie 10 Millimolar MES-Pufferlösung vor. Stellen Sie den pH-Wert mit Trinatriumhydroxid beim Rühren und Überwachen des pH-Wertes mit einem pH-Meter auf 7,4 ein.
Diese Lösung wird für die alleinige Zubereitung verwendet. Etwa 200 Milligramm nanokristallines Titanoxid in einem Mörtel mindestens fünf Minuten schleifen. Wiegen Sie 40 Milligramm Grind-Titandioxid-Nanopartikel.
Legen Sie den Kolben mit dem Laborstand in das Beschallungsbad. Das gemahlene Titandioxid in 20 Milliliter MES-Puffer in den Kolben geben und 20 Minuten lang in einem Ultraschallbad beschallen. Stellen Sie den Thermostat auf die gewünschte Temperatur ein.
Fügen Sie einen Milliliter der beschallten Sohle aus Titandioxid zu den markierten Adsorptionsfläschchen hinzu. Legen Sie die markierten Adsorptionsfläschchen gegen entsprechende Verdünnungen in eine improvisierte schwimmige Vorrichtung aus Styropor und legen Sie sie in den Thermostat, um die Temperatur für mindestens fünf Minuten zu ausstatten. Danach fügen Sie der entsprechenden markierten Adsorptionsdurchstechflasche einen Milliliter Dipeptidverdünnung hinzu, um sicherzustellen, dass alle Mischlösungen die gleiche Temperatur haben.
Bewahren Sie die Serie der erhaltenen Adsorptionsproben 24 Stunden lang an den Thermostat auf, um das Adsorptionsgleichgewicht zu erreichen. Gelegentlich rührt Titanoxid-Dispersionen während der Thermostatisierung. Um ein temperaturinduziertes Regleichgewicht zu vermeiden, nehmen Sie jeweils eine Probe aus dem Thermostat für die Filtration heraus.
Nehmen Sie eine Probe der Dipeptidlösung aus jeder Glasflasche mit einer Spritze. Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze und legen Sie den Spritzenfilter auf, um die Dipeptidlösung in die Glasflasche zu filtern. Wiederholen Sie die Filtration mit Proben anderer Konzentrationen.
Nun sind diese Proben zur Analyse bereit. Machen Sie die 50 Milliliter Lösung von TFA in Acetonitril. Spike 0,34 Milliliter TFA im Messzylinder und stellen Sie das Volumen der Lösung auf 50 Milliliter mit Acetonitril bei Raumtemperatur.
Bereiten Sie die Derivatisierungslösung vor. Spike 299 Mikroliter Phenylisothiocyanat und 347 Mikroliter Triethylamin im Messzylinder und füllen den Zylinder bis zu 50 Milliliter mit Acetonitril. Leiten Sie die Proben vor der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Analyse mit Edmans Reagenzien in den Chromatographie-Fläschchen ab.
Mischen Sie die 400 Mikroliter der Probe mit 400 Mikroliter n. L. Derivatisationsreagenz. Bewahren Sie die Proben 15 Minuten bei 60 Grad auf. Nach dem Erhitzen die Proben mit 225 Mikroliter TFA-Lösung neutralisieren und einige Minuten warten, um die Probe auf Raumtemperatur abzukühlen.
Verwenden Sie die HPLC-Analyse, um die Konzentration der Dipeptidlösung vor und nach der Adsorption zu bestimmen. Beginnen Sie die Analyse der Proben mit den notwendigen Bedingungen, die von der Software festgelegt werden. Die Abhängigkeiten der Adsorption von der Gleichgewichtsdipeptidkonzentration nach Adsorption, Adsorptionsisothermen wurden entsprechend den erhaltenen experimentellen Daten dargestellt.
Die Messungen der Dipeptidadsorption wurden mit dem Henry-Modell verarbeitet. Die Gleichgewichtsbindungskonstante wurde aus der Steigung der Abhängigkeit der Dipeptidadsorption von der Dipeptidgleichgewichtskonzentration ermittelt. Die van't Hoff-Gleichung wurde verwendet, um die Standard-Gibbs-freie Energie für jede Temperatur zu bestimmen.
Plotten in einem Diagramm der freien Energie versus Temperatur, haben wir die Enthalpie als Abfangen des linearen Graphen mit einer freien Energieachse für Dipeptid bestimmt. Die Veränderung der Entropie für jede Temperatur wurde aus der Grundgleichung bestimmt. Die berechneten Werte der Gleichgewichtsbindungskonstante, der Standard-Gibbs-Freien Energie, der Enthalpie und der Entropie für Dipeptid sind in Tabelle 1 dargestellt.
Adsorptionisotherm Konstruktion aus Erschöpfungsdaten bleibt die am meisten verfügbare Methodik, die keine teuren Setups erfordert, liefert erschöpfende physikalisch-chemische Daten für buchstäblich jeden löslichen Sorbat. In Kombination mit spektroskopischen oder computergestützten Daten kann es grundlegende strukturelle Merkmale des komplexen Verhaltens von Biomolekülen bei der Kontaktaufnahme mit den anorganischen Nanopartikeln aufdecken.
