Dieses Protokoll ermöglicht es uns, drogeneluge Stents in einem Kleintiermodell der Kehlkopfrachealstenose zu untersuchen, die es uns ermöglicht, genetisch veränderte Tiere kostengünstig zu nutzen. Die transorale Platzierung des medikamentösen Atemwegsstents erspart den Tieren einen offenen Schnitt in die Luftröhre, was ein klinisch relevanteres Modell der Kehlkopfhautstenose darstellt. Diese Technik erleichtert die präklinische Untersuchung lokaler Wirkstoffabgabestrategien zur Behandlung von Kehlkopfracherose.
Diese Technik bietet eine praktikable und effektive Plattform für die translationale Untersuchung von drogenverdünnenden Atemwegsstents in einem Kleintiermodell, die für zukünftige Untersuchungen in größeren Tiermodellen sowie für die klinische Anwendung angewendet werden können. insbesondere die transorale Intubation, die Induktion von Luftröhreverletzungen und den Stufen der Atemwegstentplatzierung. Die visuelle Demonstration dieser technisch anspruchsvollen Operation ist entscheidend, da viele der feinen Details nicht vollständig in Worten beschrieben werden können.
Um eine 1%rapamycin enthaltende Polymerlösung herzustellen, fügen Sie sechs Milligramm Rapamycin zu 600 Milligramm 70-30 PLLA-PCL in eine Glasdurchstechflasche. Unter einer Dunstabzugshaube sechs Milliliter Dichlormethan in das Rapamycin geben, das durchfläschig ergänzt wird, und durchdies durchdies andere Durchstechflasche steuern und 120 Mikroliter Glycerin zu jeder Durchstechflasche hinzufügen. Dann die Fläschchen verkappen und die PLLA-PCL-Lösung sechs bis zwölf Stunden bei Raumtemperatur homogenisieren lassen.
Um einen murinen Atemwegstent zu erzeugen, mit sterilen Materialien und Technik, wenden Sie einen Milliliter Rapamycin ergänzt PLLA-PCL Lösung auf die venöse Kanüle eines 22 Gauge fluorierten Ethylen Propylen-basierten Angiokatheters bei der Verlangsamung der Drehung des Katheters. Wenn die gesamte Lösung aufgetragen wurde, stützen Sie den geformten Angiokatheter mit der Spitze des Angiokatheters nach unten und dem Griff des Katheters am Rand einer glasigen Petrischale in einer Vakuumhaube. Nach 24 Stunden unter Vakuum bei Raumtemperatur den Katheter vorsichtig vom getrockneten Stentkonstrukt verdrehen und schieben und den Stent umlaufend auf eventuelle Defekte, die während des Gießprozesses entstanden sein könnten, überprüfen.
Um die Visualisierung zu unterstützen, ist es hilfreich, eine dünne schwarze Linie über die Länge des Stents zu zeichnen. Schneiden Sie jedes Ende der gegossenen Stents mit einer feinen geraden Schere, so dass die Kanten axial sind, und schneiden Sie jeden Stent mit der Schere in drei Millimeter axiale Segmente. Dann jeden drei Millimeter Stent auf einen neuen 22 Gauge Venenkatheter laden.
Für Laryngotrachealstenose-Induktion, nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, legen Sie die erste Maus auf eine chirurgische Plattform in der Supine-Position und Schleifen ein kleines Stück Faden an der Oberseite der Plattform um die zentralen Schneidezähne befestigt. Sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband am Tisch und machen Sie einen 1,5 Zentimeter großen vertikalen Schnitt im Hals der Maus. Teilen Sie den darüber liegenden Thymus und lateralisieren Sie die beiden resultierenden Lappen, um die Luftröhre zu visualisieren.
Teilen Sie die darüber liegenden Sternohyoid- und Sternothyreodrüsenmuskeln an der überlegenen Befestigung bilateral und passieren Sie einen 22 Gauge Angiokatheter transoral durch den Kehlkopf in die Luftröhre. Mit kleinen Zangen, Druck auf den vorderen Kehlkopf der Maus ausüben, um bei der korrekten Platzierung des Katheters zu helfen. Ein richtig platzierter Angiokatheter kann durch seine weiße Farbe durch die Luftröhre visualisiert werden.
Um die Verletzung zu induzieren, passieren Sie eine Bleomycin-beschichtete Drahtbürste durch den eingelegten Angiokatheter und ziehen Sie den Katheter langsam zurück, so dass nur die Drahtbürste innerhalb der Luftröhre verbleibt. Mit feinen Zangen den Gegendruck auf die Luftröhre auftragen, um das Luftröhrenlumen mit der Bürste mechanisch zu stören, bevor der Katheter über die Bürste wieder in die Luftröhre eingesetzt wird. Entfernen Sie die Drahtbürste und wenden Sie den Bleomycin erneut an, bevor Sie den Pinsel ein- und viermal wieder einsetzen, wie soeben gezeigt.
Nach der letzten Bleomycin-Anwendung den Katheter aus der Luftröhre entfernen. Für die transorale Platzierung einer PLLA-PCL stellen Sie sicher, dass eine dünne schwarze vertikale Linie in jeden Stent integriert wurde und intubieren Sie die Maus transoral mit dem vorinstallierten Angiokatheter. Der Stent sollte innerhalb der Luftröhre durch den transzervikalen Schnitt visualisiert werden.
Wenn der Stent an Ort und Stelle ist, verwenden Sie feine Zangen, um die Luftröhre fest zu erfassen, aber sanft durch den Schnitt zu greifen, um den Stent an Ort und Stelle zu halten und den Katheter zu entfernen. Es ist wichtig, den Stent so sorgfältig wie möglich zu platzieren. Zu viel Druck auf die Luftröhre führt zum Zusammenbruch des Stents, was zu Atemwegsverstopfungen und Tod für das Tier führt.
Schließen Sie den Schnitt mit Gewebekleber oder resorbierbaren 4-0 Chromnähten, die hier verwendet werden, und lassen Sie die Maus sich mit Überwachung erholen, bevor sie das Tier in seinen Hauskäfig zurückgibt. Platzieren Sie die Maus des Interesses am entsprechenden experimentellen Endpunkt in der Supine-Position auf der chirurgischen Plattform und verwenden Sie eine fein gekrümmte Irisschere, um den Schnitt wieder zu öffnen. Setzen Sie die Luftröhre wie gezeigt aus und teilen Sie die distale Luftröhre mit der Schere unter die Höhe des Stents.
Als nächstes teilen Sie die proximale Luftröhre unterhalb des Kehlkopfes und oberhalb des Stents und trennen Sie die geteilte Luftröhre von der Speiseröhre nachträvoll. Dann entfernen Sie den Stent aus der Luftröhre und fixieren Sie die Luftröhre in 10%formalin für 24 Stunden. Das biologisch abbaubare rapamycin geladene PLLA-PCL-Stentkonstrukt, das in dieser Studie verwendet wird, ist in der Lage, Rapamycin in konsistenter und vorhersehbarer Weise unter physiologischen Bedingungen zu elutieren.
In diesem Bild kann der miniaturisierte biokompatible Stent an Ort und Stellen innerhalb der Luftröhre beobachtet werden, wie der schwarze Marker auf dem Stent zeigt, der durch die transluzente Mausluftröhre visualisiert wird. Nach 21 Tagen kann der schwarze Farbstoffmarker verwendet werden, um die Aufrechterhaltung der Stentposition innerhalb der Luftröhre zu bestätigen. Biokompatibilitätstests mit immunfluoreszierender Färbung für Marker akuter und chronischer Entzündungen zeigen, dass das PLLA-PCL-Stentkonstrukt nicht immunreaktiv ist, wie durch die minimale Anzahl von Immunzellen bestimmt wird, die nach der Platzierung in Abwesenheit von Verletzungen vorhanden sind.
Die feinfühlige und atraumatische Manipulation der Atemwege ist entscheidend für den Erfolg des Verfahrens. Übermäßige Kraft, mehrere Intubationen und Stentkollaps können zum Tod von Tieren führen. Nach der Behandlung mit Rapamycin-elutierendem Stent kann die Beurteilung des Überlebens, die Genexpression mittels quantitativer Echtzeit-PCR, Immunoassay einschließlich Durchflusszytometrie, ELISA und Immunhistochemie durchgeführt werden.
Da es eine erfolgreiche Plattform für die Arzneimittelelution in einem Mausmodell bietet, ebnet diese Technik den Weg für zukünftige Untersuchungen lokal angewendeter Therapeutika bei Laryngotrachealstenose. Dichlormethan ist eine korrosive Flüssigkeit. Achten Sie darauf, immer eine Dunstabzugshaube, persönliche Schutzausrüstung und nicht korrosive Materialien zu verwenden
