Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, eine Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Makrophagen 4T1 Maus Mammakarzinomzellen in Kokulturen zu erhalten. Das Modell der Lebenszellen-Kokulturen wurde mit einer Kombination aus fluoreszierender und differentialer Interferenzkontrastmikroskopie etabliert und beobachtet. Die Bewertung der Phagozytose-Aktivität durch Makrophagen waren Bild;mit Bildgebungssoftware, um Multi-Point-Zeitraffer-Video zu verdoppeln, bevor unsere Inkubation getestet wurde.
Die Materie, die wir durchgeführt haben, um die Bedürfnisse und Vorteile der Honing im Verhalten von Makrophagen und seine phagozytische Aktivität mit Krebszellen zu erfüllen. Konkret in der Studie ist Maus-Mammakarzinom. Der erste Teil dieser Studie beginnt mit dem Kokulturmodell der lebenden Zellen von 4T1-Maus-Mammakarzinomzellen und RAW 2647-Mausmakrophagen.
Beginnen Sie das Experiment, indem Sie 41 Maus-Mammakarzinomzellen und RAW 2647-Mausmakrophagen kultivieren. Zuerst tauen Sie eine Durchstechflasche mit 4T1- und RAW 2647-Zellen auf. Verdünnen Sie die aufgetauten Zellen in 10 Millimetern in einem 15-Millimeter-Konusrohr.
Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen mit 660 g Kraft für 5 Minuten, um Zellpellet zu erhalten. Sorgsam die Medien zu aspirieren, die Zellen in 8 Mill kompletter Medien wieder auszusetzen und die Zellen in einen Gewebekulturkolben zu übertragen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 Prozent Kohlendioxid.
Nach einer Woche der Kultivierung unter anhaftenden Bedingungen, überwachen Sie den Kolben täglich und ergänzen Sie mit atmil komplette Medien nach Bedarf. Der nächste Schritt geht mit der Immunfärbung von M1 polarisierten RAW 2647 Makrophagen weiter. In diesem Schritt soll eine vollständige Polarisation der M1-Makrophagen sichergestellt werden.
Da die Konfluenz von RAW 2647 erreicht ist, verwerfen 70 bis 80 Prozent die Kulturmedien und spülen sie zweimal mit PBS sanft ab. Bereiten Sie die Makrophagen für die Entnahme vor, indem Sie die anhaftenden Zellen vorsichtig mit einem Zell-Schrotter entfernen und in ein 50-Mühlen-Konusrohr übertragen. Zählen Sie Zellen mit Hilfe des Hämozytometers und bereiten Sie eine Zelle vor, die mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Schale suspensioniert wird, indem Sie die verbleibende Lösung zur Sitzdichte hinzufügen.
Sitzen Sie 2 Mill Makrophagen Suspension in zwei bildgebende Gerichte. Inkubieren Sie die Zellen 2 bis 3 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 Prozent Kohlendioxid, um die Zellhaftung zu ermöglichen. Bereiten Sie M1 Polarisationsmedien vor, indem Sie 100 Nilligramm pro Mill LPS und 20 Nilligramm pro Mill Interferon-gamma in ein komplettes Medium einfügt, das mit 10 Prozent FBS ergänzt wird.
Entsorgen Sie die Kulturen, die von Makrophagen, die vorher inkubiert wurden, überlagern und waschen Sie die Monolayer in der Schale zweimal mit PBS. Fügen Sie 2 Mill. M1 Polarisationsmedien in eines der passenden Gerichte ein und lassen Sie die Dura-Zellen in M1-Makrophagen finnatyp einfließen. Fixieren Sie vor der Immunfärbung RAW- und M1-Makrophagenzellen mit 2 Mill von 4 Prozent Paraformaldehyd und inkubieren Sie 50 Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen monolayer mit PBS, mindestens dreimal. Mit 2 Mill 50 Millimeter Ammoniumchlorid in PBS quen und 50 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Permeabilisieren Sie mit 0,3 Prozent Triton X-100 in PBS für 50 Minuten bei Raumtemperatur.
Blockierschritt mit 10 Prozent FBS für 30 Minuten bei PBS-Raumtemperatur. Inkubieren Sie mit Anti-INOS-Antikörper konjugierten FITC in PBS und ein Prozent FBS über Nacht bei 4 Grad Celsius. 1 Mill. DAPI in bildgebende Geschirrfür 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in dunklem Zustand inkubieren, indem Sie sie mit Aluminiumfolie abdecken.
Waschen Sie Zellen mit PBS mindestens 3 Mal und fügen Sie 1 Mühle DMEM in passende Gerichte und bereit für Fluoreszenz-Bildgebung. Der nächste Schritt geht mit der Aussaat von 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen. Da die Konfluenz von 4T1-Zellen 70 bis 80 Prozent erreichen, entsorgen die Kulturmedien und spülen sie zweimal mit PBS sanft ab.
Fügen Sie 1 Mill. vorgewärmtes Trypsin hinzu, um die Zellen zu entkoppeln und bis zu 20 Minuten bei 37 Grad Celsius zu brüten. Sobald die Zellen de-attached erscheinen, übertragen Sie die de-attached Zellen zu einem 15-Mühlen-Konischen Rohr. Und fügen Sie 2 Mill von vorgewärmten komplette Medium, um die Röhre gesehen zu inaktivieren.
Zentrifuge bei 600 g Kraft für 5 Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 10-Mill-Prerun-Probenahme DMEM Medium. Zählen Sie die Zellen mit Hilfe von Hämozytometer und Samen 100. 000 Zellen in Mühle DMEM.
In die Abbildung dieser mit TC behandelt. Der nächste Schritt ist die Kennzeichnung lebender 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen mit CFSE-Färbung. Entfernen Sie zunächst die vorhandenen Medien aus der bildgebenden Schale, die zuvor mit 4T1-Zellen gesät wurde.
Bereiten Sie CFSE Färbung Lösung durch Verdünnung CFSE Färbung in 1 Mühle PBS, um 5 macrmal out Arbeitszustimmung zu machen. Fügen Sie 1 Mill. CFSE-Färbelösung in die bildgebende Schale ein, um Zellen für 20 Minuten bei Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius im Dunkeln zu inkubieren. Fügen Sie den Zellen ein gleich DMEM plus Färbelösung hinzu und lassen Sie 5 Minuten säen.
Der nächste Schritt besteht darin, RAW2647 Mausmakrophagen und Co-Kultur mit 4T1 auszusäen. Nach dem CFSE-Nivellierung von 4T1-Zellen die Bildform zweimal mit PBS waschen. Samen 2 Mill Makrophagen Suspension in 4T1 Bildform.
Der nächste Schritt besteht darin, RAW 4627 Makrophagen in M1-Finnatyp zu polarisieren. Fügen Sie 2 Mill. M1 Polarisationsmedien in die Imagine-Schale ein und lassen Sie die RAW-Zellen in M1-Makrophage-Finnatyp einfließen. Der zweite Teil der Studie ist die Zeitrafferbewertung von M1-Makrophagen, die 4T1-Zellen gephagogiert haben.
Der nächste Schritt umfasst die Bewertung der Live-Zell-Videomikroskopie-Phagozytose. Schalten Sie zunächst das Mikroskop ein. Temperatur bei 37 Grad Celsius einstellen.
Und 5 Prozent Kohlendioxidgas. Positionieren Sie die Co-Kulturzellen in der Mitte der Bühne und schrauben Sie vorsichtig an der oberen Kammer. Verwenden Sie den Joystick, um die Bühne zu motorisieren, indem Sie eine andere Position auswählen, die erfasst werden soll.
Bei der Live-Zell-Bildgebung müssen viele Faktoren berücksichtigt werden. Um ein ziemlich kleines Video zu erhalten. Es erfordert die Optimierung der bildgebenden Belichtung, Zeitmessung und auch die Automatisierung der Fokuskorrektur.
Falls das Video überbelichtet ist, kostet ein falsches Zeitintervall und auch ablätgemäßes Video, dass es unbrauchbar ist. Eine Wiederholung des Experiments muss durchgeführt werden, wenn einer dieser Faktoren erkannt wurde. Abbildung 1 zeigt Immunfluoreszenzen, die sich mit Anti-INOS in Grün drehen.
Nuklearmarker DAPI in blau. Und verbesserte Versionen der meisten Bilder. Movie 1 ist ein repräsentativer Live-Zell-Film über das Verständnis von M1-Makrophagen und 4T1.
CFSE färbte die meisten Mammakarzinome-Zellen Kokulturen, die mit mehrkanaligem Erwerb von Floreszenz und der IC-Mikroskopie erfasst wurden. Film 2 Live-Zell-Videomikroskopie-Filme von Multi-Point in einem einzigen ehelichen Gericht. Zeigen der Phagozytose von 4T1 durch induzierte M1-Makrophagen.
Die Bilder wurden im 50-Minuten-Takt für 13 Stunden aufgenommen. Film 3 Live-Zell-Videomikroskopie-Film, von einem einzelnen Koordinatenpunkt gewählt, um eine detaillierte Visualisierung der Phagozytose von 4T1 von M1 Makrophagen zu zeigen. Rote Pfeile zeigen zu M1 Makrophagen, gelber Kreis zeigt, dass eine Reihe von 4T1-Zellen Fluoren und Goffman von 4T1-Zellen auslöschen.
M1 Makrophagen Bewegungsologie beschreiben als Porocytoplasma waren als 4T1 Maus Speicher karzinome haben eine Epithelmorphologie. Makrophagen können gesehen werden, die sich bewegen, um 4T1-Zellen hinzuzufügen, um den Zell-zu-Zellen-Kontakt herzustellen. Darauf folgt die Aufnahme von 4T1-Zellen pro M1-Makrophagen.
Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Live-Zell-Videomikroskopie-Experimente durchführen können;mit 4T1 Maus-Mammakarzinom und RAW 2647 Meradmakrophagen. Sie sollten auch in der Lage sein, über Nacht Ko-Kulturen beider Zelltypen einzurichten, um Phagozytose-Essay durchzuführen. Sie sollten auch verstehen, wie die Co-Kultuer von 4T1 mit LPS und Interferon-Gamma-Makrophagen.
