Dies könnte dazu beitragen, wichtige Fragen zu beantworten, wie DCAF-Moleküle mit der gezielten Antikörperneutralisation synthetisiert werden können. Diese Technik bietet die einfachste Möglichkeit, die DCAF-Moleküle mit hoher Produktivität zu synthetisieren. Die Welt entscheidet DCAF-Moleküle haben die potenziellen Eingriffe in den Antikörper in Umgang mit Krankheiten wie dem Dengue-Fieber und der Myasthenia gravis.
Diese Methode kann auf andere DCAF-Moleküle mit verschiedenen Epitopen angewendet werden, um die Cognate-Antikörper zu zielen. Demonstriert wird das Verfahren von Xue Bai, einem leitenden Techniker aus meinem Labor. Um 2-Chlorharz in hydrazin abgeleitetes 2-Chlorharz von der Oberseite des Peptidsynthesegefäßes umzuwandeln, fügen Sie fünf Milliliter DMF zu den 0,25 Millimolen 2-Chlorharz hinzu.
Setzen Sie die Kappe wieder auf, schütteln Sie das Gefäß 15 Sekunden lang sanft und entleeren Sie es dann auf einem Eisenständer. Wiederholen Sie das DMF-Waschen zwei weitere Male. Dann fügen Sie dem Gefäß fünf Milliliter DCM hinzu, legen Sie die Kappe wieder auf, schütteln Sie das Gefäß 15 Sekunden lang sanft und entleeren Sie es dann auf einem Eisenständer.
Wiederholen Sie das DCM-Waschen zwei weitere Male, und wiederholen Sie dann das DMF-Waschen drei weitere Male. Als nächstes fügen Sie sechs Milliliter einer 50%volumenmäßigen DMF-Konzentration über DCM hinzu, um das Harz 30 Minuten lang anzuschwellen und dann abzutropfen. Übertragen Sie nun sechs Milliliter einer Volumenkonzentration von 5% Hydrazin und DMF auf das Reaktionsgefäß.
Legen Sie es 30 Minuten lang auf den Shaker bei 120 Umdrehungen pro Minute und 30 Grad Celsius, und entleeren Sie die Lösung dann per Vakuumpumpe. Um das Hydrazinderivat eines Fc-III-Peptids zu reinigen, verwenden Sie das HPLC-System, um das Peptid mit einer 30-minütigen Gradienten-Anspielungse mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute zu reinigen. Nach der Proteinreinigung nach dem Manuskript zwei Milliliter von einem Milligramm pro Milliliter SUMO-taggtes Protein, einen Milliliter SUMO-Protease, einen Milliliter 10-fachen SUMO-Proteasepuffer und sechs Milliliter doppeldestilliertes Wasser in eine neue Röhre geben, um die Reaktionslösung vorzubereiten.
Die Mischung 12 bis 16 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Dann aliquot die Mischung in acht 1,5 Milliliter Eppendorf Rohre, und zentrifugieren Sie die Mischung bei 15 000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine Pipette, um die Aggregate am Boden zu entsorgen, dann in die 10 Milliliter gelöschten Überräuer, fügen Sie 0,5 Milliliter der 50% Nickel NTA Perle Gülle in 50 Millimolar PBS.
Legen Sie das Rohr an einem Drehschüttler bei 200 U/min und vier Grad Celsius, um es 60 Minuten lang sanft zu mischen. Als nächstes laden Sie die Lisade und das Nickel-NTA-Gemisch in eine Säule mit der unteren Auslasskappe. Entfernen Sie die untere Kappe und speichern Sie den Durchfluss in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr.
Das HIS TAG SUMO Protein ist an der Säule bindend. Der Linker-Antigenteil, der mit CIS für die native chemische Ligationsreaktion beginnt, befindet sich im Durchfluss. Nun 1,8 Milligramm Hydrazinderivat eines Fc-III-Peptids in eine zwei Milliliter Eppendorf-Röhre gewichten und 0,8 Milliliter von sechs Molguanidiniumchlorid in 0,2 Molmononatriumphosphatlösung bei pH 3 hinzufügen.
Wirbel, um das Pulver aufzulösen. Nach zentrifugieren des Rohres bei 7, 200 mal G für eine Minute bei Raumtemperatur übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr. Fügen Sie einen Rührstab in die Röhre und legen Sie die Röhre in einem Eissalzbad auf einem magnetischen Rührer, um die Lösung für 15 Minuten sanft zu rühren.
Dann fügen Sie 40 Mikroliter 0,5 molesNatriumnitrit in die Lösung, um die Hydrazin-Gruppe zu oxidieren. Rühren Sie die Lösung im Eissalzbad für weitere 15 Minuten vorsichtig auf. Wiegen Sie bei 11 Milligramm des HPLC gereinigten und gefriergetrockneten Linker-Antigenteils und 13,6 Milligramm MPAA in das Reaktionsrohr im Eissalzbad.
Fünf Minuten umrühren und dann den pH-Wert mit sechs Mol-Natriumhydroxid auf 6,8 bis 7,0 im Raumtemperieren einstellen. Der wichtigste Schritt für die native chemische Ligation ist die sorgfältige Einstellung des pH-Wertes, um die Ligationsreaktion zu initiieren. Nach 12 Stunden im Eissalzbad 0,4 Milliliter 0,1 Molar TCEP neutrale Lösung in das Reaktionssystem geben und 20 Minuten rühren, um die Reaktion zu beenden.
Nach Zentrifugation und HPLC-Reinigung erhalten Sie den Konjugat-Peak III zur Entschwefelung. Lösen Sie es in 50 Mikroliter n.Ä. sechs Molguanidiniumchlorid in 0,2 Molmononatriumphosphatlösung. Dann 50 Mikroliter eines molaren TCEP, 10 Mikroliter Tert-Butylthiol und fünf Mikroliter 0,1 Molaren VAO für vier Lösungen hinzufügen.
Stellen Sie den endgültigen pH-Wert der Lösung auf 6,9 ein und halten Sie die Lösung etwa fünf Stunden auf einem Shaker bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren und wieder reinigen. Das zubereitete Peptid in 200 Mikroliter 32 Millimolar-Silberacetat auflösen und dann vier Stunden lang bei Raumtemperatur rühren.
Um die Silberthiolate auf Peptid in freie Thiole umzuwandeln, fügen Sie drei Mikroliter eines Molaren DTT in sechs Molguanidiniumchlorid und 0,2 molmolem Mononatriumphosphat bei pH 7 hinzu. Betreiben Sie das Massenspektrometer im vollwertigen Scan-Modus und stellen Sie den m/z-Bereich auf 300 bis 2 000 und die Auflösung auf 60 000 ein. Öffnen Sie die Massenspektrendaten und finden Sie die Spitzen des Produkts in jedem Schritt, um zu bestätigen, dass die chemische Reaktion erfolgreich durchgeführt wird.
Um eLISA-Test der Wechselwirkung zwischen DCAF1- und 4G2-Antikörpern durchzuführen, beschichten Sie jeden Brunnen einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit einem Picomol Anti-GST-Antikörper in 100 Mikroliter Beschichtungspuffer. Versiegeln Sie die Platte mit Dichtbändern und bebrüten Sie sie bei 4 Grad Celsius über Nacht auf einem Shaker. Am Morgen blocken Sie jeweils einen Brunnen mit 200 Mikrolitern 1%BSA und PBS.
Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie es Zimmer gemäßigt für eine Stunde auf einem Shaker. Dann verwenden SIE PBS mit 0.05%Tween 20, um jeden Brunnen viermal zu waschen. In diesem Protokoll wurde die native chemische Ligationsmethode für die Semisynthese des DCAF1-Moleküls verwendet.
Das Massenspektrum zeigt, dass das letzte DCAF1-Molekül ein dekonvolutionales Molekulargewicht von 11, 053 hat. Während des ELISA-Assays hemmen Antigenpeptid Fc-III und DCAF1 die 4G2-Antikörperbindung. Sowohl Antigenpeptid als auch DCAF1 blockierten signifikant die 4G2-Bindung, während das Fc-III-Peptit die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung nicht beeinflusste.
Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für einen Eingriff schädlicher Antikörper-assoziierter Krankheiten. Viele der Regionen, die für die Peptidsynthese und native chemische Ligation verwendet werden, sind hochgiftig. Achten Sie darauf, diese Experimente in Ihrer chemischen Haube zu nehmen.
