Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die Interaktionsdynamik und die Auflösung der Holliday-Kreuzung durch Klappenendonuklease 1 auf der Ebene des einzelnen Moleküls und anderen enzymatischen Systemen zu überwachen. Nun, einige werden mittelmittelisierenin in der gesamten molekularen Population oder sichert die zugrunde liegenden einzelnen mechanistischen Schritte und es gibt. Einzelne Molekülmethoden liefern diese Details, indem sie das Echtzeitverhalten einzelner Moleküle überwachen.
Einzelmolekülmethoden können biomolekulare Wechselwirkungen im Pico- und Nanomolar-Bereich mit hoher Spezifität effizient detektieren. Was für viele praktische Lösungen in der Diagnostik, Genomsequenzierung und Sensorik praktisch ist. Optische und erzwungene Mess-Einzelmolekül-Methoden sind in Physik, Chemie und Biologie weit verbreitet und liefern nachweislich edle Beobachtungen, die durch andere Methoden unzugänglich sind.
Mein Rat an Erstanwender ist, die detaillierten Schritte in diesem Protokoll genau zu befolgen. Visuelle Darstellungen des praktischen Verfahrens dieses Protokolls führen zu einer erfolgreichen Implementierung der Technik. Zur Vorbereitung der einkanaligen Durchflusszelle bohren Sie zunächst zwei Löcher mit einem Durchmesser von 1,22 Millimetern im mittleren Teil eines 50 mal 20 Millimeter großen Quarzschlittens mit den Mitten 37 Millimeter auseinander und 6,5 Millimeter vom Rand des Schlittens entfernt.
Verwenden Sie einen elektronischen Fräser, um einen 41 mal 2,25 Millimeter großen Kanal in ein 50 mal 20 Millimeter großes Stück einer doppelten Klebefolie zu schneiden und die Kunststoffseite der Schutzhülle abzuschälen. Richten Sie die Ränder des Stückes an den Rändern des Quarzschlittens aus und verwenden Sie eine Pinzette aus Polytetrafluorethylen, um alle eingeschlossenen Luftblasen sanft zu entfernen. Ziehen Sie die Papierseite des Klebestücks ab und montieren Sie das Stück auf die funktionalisierte Oberfläche eines Deckelschlupfes.
Als nächstes schneiden Sie ein Stück Polyethylenschläuche mit einem Innendurchmesser von 1,22 Millimetern auf eine Länge von 11 Zentimetern für den Einlass und ein Stück Schläuche auf 25 Zentimeter für den Auslass. Dann legen Sie die Rohre in die zuvor gebohrten Löcher als Ein- und Auslassrohre für die Durchflusszelle ein. Und verwenden Sie fünfminütigen Epoxidkleber, um die Kanten der Quarzabdeckungs-Beleg-Schnittstelle in den Ein- und Auslassrohren zu versiegeln.
Wenn die Zelle getrocknet ist, verwenden Sie eine 1-Millimeter-Spritze, um 0,2 Mikrometer gefiltert 0,03 Milligramm pro Milliliter Konzentration Avidin in PBS in die Zelle mit einer zweiten Spritze gefüllt mit Puffer allein zu spülen, um überschüssiges Avidin am Ende der Profusion auszuwaschen. Um ein einfarbiges FRET-Experiment durchzuführen, wenden Sie zunächst einen Tropfen Tauchöl auf ein 100-faches gesamtes internes Reflexionsfluoreszenzziel auf und stellen sie die Aufschip-Multiplikation von Photoelektronen auf eine geeignete Verstärkung, um das Signal zum Hintergrund zu optimieren und Sättigung zu verhindern. Legen Sie die Durchflusszelle vorsichtig auf den Probenhalter, und verwenden Sie die Kurseinstellung, um das Ziel schrittweise anzuheben, bis das Öl den Deckelschlupf berührt.
Schalten Sie den 532-Nanometer-Laser ein und wechseln Sie in den Feineinstellungsmodus des Objektivs. Richten Sie die Emission an den Kameraanschluss, um das Bild auf dem Monitor zu beobachten und die Höhe des Objektivs anzupassen, bis die funktionalisierte Oberfläche des Abdeckschlupfes in den Fokus gerückt wird und auf dem Monitor beobachtet werden kann. Stellen Sie fest, dass der Hintergrund der funktionalisierten Oberfläche der Abdeckungsrutschen einige Stellen nicht überschreitet, bevor Sie in die fluoreszierend markierte HJ fließen. Wenn das System bei 0,2 bis 0,5 Mikroliter des verdünnten Substrats von Interesse in 120 Mikroliter Bildgebungspuffer mit Sauerstoff-Aufräumsystem in einem 0,5-Milliliter-Rohr bereit ist und den Ausgang der langsamen Zelle mit einer Spritzenpumpe verbinden.
Legen Sie das Einlassrohr in das 1,5-Milliliter-Rohr ein und starten Sie die Spritzenpumpe mit 30 bis 50 Mikroliter pro Minute, um die Lösung aus dem Rohr zu ziehen. Stellen Sie die Oberfläche häufig kurz mit dem grünen Laser ab, um eine gute Abdeckung der Zelle mit 100 bis 300 Partikeln homogen verteilten, gut verteilten Substrats zu bestätigen. Wenn die Durchflusszelloberfläche ausreichend abgedeckt ist, spülen Sie weitere 120 Mikroliter Bildgebungspuffer bei 30 bis 50 Mikroliter pro Minute, um ungebundene HJ wegzuwaschen und die Durchflusszelle 5 Minuten lang sitzen zu lassen, damit das Sauerstoff-Aufräumsystem den gelösten Sauerstoff erschöpft.
Stellen Sie die Belichtungszeit auf ca. 60 Millisekunden ein. Die Zykluszeit wird von der Software automatisch basierend auf der Geschwindigkeit der Datenübertragung eingestellt. Geben Sie die gewünschte Anzahl von Zyklen oder Rahmen auf etwa 400 an.
Die Emission von Spender- und Akzeptor-Fluorophoren wird durch ein Bildteilergerät in Farbkanäle aufgeteilt. Wählen Sie einen geeigneten Bereich auf der Oberfläche aus, passen Sie die Höhe des Ziels an, um das Bild zu fokussieren und aufzunehmen, und speichern Sie den Film im 16-Bit-Tiff-Format. Dann bewegen Sie sich in einen neuen Bereich.
Spülen Sie die Zelle mit 120 Mikroliterbildpuffer, ergänzt mit den angegebenen Gen1-Konzentrationen bei einem Durchfluss von 30 Mikrolitern pro Minute, jeweils eine Konzentration. Passen Sie in der Auflösung des HJ-Spaltungsexperiments die Durchflussrate auf 110 Mikroliter pro Minute an und starten Sie die Aufzeichnung 5 bis 10 Sekunden vor dem Eintritt des Enzyms in die Durchflusszelle. Die Bildgebung, die 5 bis 10 Sekunden vor dem Eindringen des Enzyms in die Durchflusszelle beginnt, maximiert die Anzahl der Ereignisse.
Wenn alle Konzentrationen getestet wurden, verwenden Sie eine feste fluoreszierende Perlenfolie, um die Spender- und Akzeptorpartikel einander in der Bildspaltvorrichtung zuzuordnen. Nach der Installation des entsprechenden Softwarepakets zur Generierung einer Transformationsmatrix öffnen Sie den aufgezeichneten Perlendiafilm und wählen Sie die Positionen der einzelnen Perlen in den Spender- und Akzeptorkanälen aus. Wenn die Matrix aus dem festen Perlenschieberegler generiert wurde, klicken Sie auf TFORM laden und wählen Sie die Transformationsmatrixdatei aus.
Klicken Sie im Dropdown-Menü Kanalfilter auf die Option "D&A", um Partikel auszuwählen, die sowohl mit dem Spender als auch mit dem Akzeptor beschriftet sind. Geben Sie dann plotTimetraceCW ein, wie im Handbuch angewiesen, um die Zeitspuren für jedes Molekül zu generieren. Um ein ALEX FRET-Experiment durchzuführen, nehmen Sie einen Film auf, der aus aufeinanderfolgenden Frames von Spender- und Akzeptoremissionen durch direkte Anregungen mit den grünen und roten Lasern besteht.
Öffnen Sie die erworbenen ALEX-Filme und legen Sie die geeignete Nachweisschwelle auf ca. 300 für jede Spenderemission aufgrund von Spenderanregung, Akzeptoremission aufgrund von Spendererregung und Akzeptanzemission aufgrund der direkten Erregungskanäle fest. Wenden Sie die entsprechenden Kanalfilter an, um für die Partikel auszuwählen, die sowohl Spender als auch Akzeptor waren, und verbinden Sie 200 bis 300 Partikel in jedem der drei Kanäle. Verwenden Sie den plotHistALEX MATLAB-Code, um ALEX-Histogramme zu generieren, die verschiedene Spitzen in den Funktionen des Histogramms anpassen, und verwenden Sie ein geeignetes Graphik- und Analyseprogramm, um den Prozentsatz der Fläche unter der Kurve für jede Grundgesamtheit zu bestimmen.
Verwenden Sie dann den PlotTimetraceALEX MATLAB-Code, um eine Zeitspur für jedes Molekül zu erzeugen, das die Spenderemission durch die direkte Anregung in den Akzeptoremissionen durch das FRET und die direkte Anregung zeigt. Dieses repräsentative abwechselnde Anregungs-FRET-Histogramm des benachbarten Etiketts X-0 zeigt zwei Spitzen, die dem Wechsel der reichlicheren und weniger reichlich vorhandenen Isomere entsprechen. Die Isomerisierungsraten, die aus den Dwell-Zeit-Histogrammen der Isomere gewonnen wurden, stimmen mit den zuvor berichteten überein.
Einzelne FRET-Histogramme der benachbarten Bezeichnung X-0-Kreuzung in verschiedenen GEN1-Konzentrationen, die von ALEX erworben wurden, zeigen einen Peak, der dem freien hohen FRET-Isomer entspricht, und einen Peak, der der gebundenen HJ-Population entspricht, nachdem der Beitrag des weniger reichlich vorhandenen Isomers vom niedrigen FRET-Peak subtrahiert wurde. Bei einer sättigenden GEN1-Konzentration hat das FRET-Histogramm von X-0 nur einen einzigen niedrigen FRET-Peak, der GEN1 entspricht, der entweder an Isomer des HJ gebunden ist, wie vom Modell vorhergesagt. Die Bindung von GEN1-Monomer an das HJ gefolgt von Dimer-Formation ist ein einzigartiges Merkmal der eukaryotischen HJ-Resolvase GEN1 im Vergleich zu prokaryotischen Resolvasen, die in dimerer Form in Lösung existieren.
Ein weiterer Beweis dafür, dass GEN1-Monomer das HJ bindet und verzerrt, ist die Beobachtung einer signifikanten Anzahl von Spuren von uncleaved Partikeln mit einem stabilen niedrigen FRET-Zustand in Gegenwart von Magnesium bei niedrigen GEN1-Konzentrationen. Die gleichzeitige Abreise des Spenders und des Akzeptors nach einem stabilen niedrigen FRET-Zustand in Spuren von gelöstem X-0, die ohne das Entstehen eines Zwischenprodukts auftritt, weist darauf hin, dass eine vollständige Auflösung innerhalb der Lebensdauer des GEN1 HJ-Komplexes auftritt. Beachten Sie, dass der Hintergrund von der funktionalisierten Glasoberfläche einige Flecken nicht überschreiten sollte und dass gleichmäßig verteilte Partikel für gute Ergebnisse unerlässlich sind.
Verwenden Sie immer persönliche Schutzausrüstung und eine Dunstabzugshaube bei der Vorbereitung des Serialisierungsbildes. Achten Sie darauf, bei der Arbeit mit Lasern eine Schutzbrille zu tragen, die spezifisch für die Wellenlängen ist. Andere Methoden wie Kryo ap, Kernspinresonanz, können strukturelle Details auf atomarer Ebene liefern.
Diese Informationen sind integraler Bestandteil für die Konzeption und Interpretation der einzelnen MOLEKÜL-FRET-Experimente. Einzelmolekül FRET eröffnet neue Ansichten auf dem Gebiet der DNA-Replikation, was zu einem tieferen Verständnis der Mechanismen von Aktionen Helicases und Nukleasen führt.
