Endocannabinoide sind konservierte Lipidmediatoren, die mehrere biologische Prozesse in einer Vielzahl von Organismen regulieren. Die ersten entdeckten Endocannabinoide sind Anandamid und 2-Arachidonoylglycerol, 2-AG. Die Nematode C.elegans ist ein leistungsfähiges Tiermodell, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen zu studieren.
Kürzlich haben wir festgestellt, dass die 2-AG eine grundlegende Rolle bei der Regulierung des Cholesterinhandels in C.elegans spielt. Aus diesem Grund wurde es zwingend erforderlich, eine Methode zur Untersuchung der endogenen 2-AG durch Nachweis und Quantifizierung in C.elegans zu entwerfen und zu optimieren. Zuvor gemeldete Analysemethoden zur Quantifizierung von 2-AG in biologischen Proben beinhalten in der Regel die Verwendung von deuterated Standards, die kommerziell erworben werden müssen, um sie zum Kauf zur Verfügung zu haben.
Dennoch sind sie teuer, und aufgrund des Vorhandenseins von mehreren Doppelbindungen, sind empfindlich, um im Laufe der Zeit oxidiert zu werden. Die gängigste Version der Normen basiert auf der octadeuterated arachidonsäure, die für die Quantifizierung durch Isotopenverdünnung, durch Flüssigchromatographie und hintere Massenspektroskopie geeignet ist. Um die Mitkosten und Stabilität der deuterated Standards zur Quantifizierung von 2-AG zu überwinden, haben wir eine bequeme und einfache Methode verwendet, um einen analytischen Standard auf der Grundlage von Deuterium-5-Glycerin vorzubereiten.
Die Reihenfolge zur Vorbereitung des gepeuteten Standards erfordert ein dreimonatiges Verfahren. Die Möglichkeit, in der geschützten Form zu halten, bis es benötigt wird. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, eine vollständige Methode zur Untersuchung von 2-AG in C.elegans von der Synthese des analytischen deuterated Standard über die Herstellung und Extraktion der Nematodenproben und schließlich die Analyse durch Flüssigchromatographie und Massenspektroskopie zu zeigen.
Zur Gewinnung von deuterated 1-AG als deuterated interner Standard für Quantifizierungstests folgen Sie einem dreistufigen Protokoll. Um nur Primäralkohole zu schützen, fügen Sie zunächst 38 Milligramm Glycerin, das mit einer Pasteurpipette zu einem 10-Milliliter-Reaktionsrohr deuteriert wird, und fügen Sie einen magnetischen Rührer hinzu. Als nächstes fügen Sie fünf Milliliter wasserfreies DCM mit einer Fünf-Milliliter Hamilton-Spritze hinzu und füllen Sie das Rohr mit trockenem Stickstoff, um eine inerte Atmosphäre zu geben.
Bereiten Sie ein Bad mit einem flachen Dewar-Kolben mit destilliertem Ethylacetat gefüllt. Füllen Sie das hermetisch geschlossene Reaktionsrohr im Bad und kühlen Sie es, indem Sie den zusetzenden flüssigen Stickstoff zu Ethylacetat langsam abkühlen, bis das Lösungsmittel eingefroren ist. Vorsicht, Flüssigkeit kocht bei Raumtemperatur heftig und kann bei Kontakt mit Augen und Haut zu schweren Verbrennungen führen.
Als nächstes fügen Sie 54 Milligramm wasserfreies Collidine mit einer Hamilton-Spritze hinzu. Vorsicht, Collidine ist flüchtig und hat einen sehr starken und unangenehmen Geruch. Bei 70 Milligramm Terbutil-Dimethyl-Cetylchlorid und rühren alles für drei Stunden bei minus 78 Grad auf einem magnetischen Rührer.
Fügen Sie zwei Milliliter Sole hinzu, um die Reaktion zu löschen. Extrahieren Sie die Lösung mit zwei Milliliterdestilliertem Dichlormethan dreimal mit einem getrennten Trichter, der die organischen Extrakte jedes Mal hält. Dann die drei organischen Extrakte kombinieren und über Natriumsulfit trocknen.
Reinigen Sie das Rohgemisch durch Säulenchromatographie mit Kieselgel als stationäre reine Phase und einem 10%steigenden Hexanethylacetatgradienten ab 100% Hexan und Endbearbeitung mit 100%ethylacetat. Für diesen Veresterungsschritt 10 Milligramm des zuvor angegebenen Produkts zu einem 10-Milliliter-Reaktionsrohr mit einem Pasteur Pippette hinzufügen und einen magnetischen Rührer hinzufügen. Fügen Sie zwei Milliliter wasserfreies DCM mit einer Fünf-Milliliter Hamilton-Spritze hinzu und füllen Sie das Rohr mit trockenem Stickstoff, um eine inerte Atmosphäre zu erhalten.
Kühlen Sie die Lösung mit einem Eisbad auf null Grad. Ad 36 Milligramm Arachidonsäure mit einer multi-Volume einstellbaren Mikropipette und rühren. Dann 15 Milligramm 40-Methyl-Aminopyridin hinzufügen und rühren.
Fügen Sie 15 Milligramm Diacylpropylcarbodiimid mit einer multi-Volume einstellbaren Mikropipette und rühren. Fügen Sie zwei Milliliter Wasser hinzu, um die Reaktion zu löschen und extrahieren Sie die Lösung dann mit zwei Millilitern destilliertem DCM dreimal mit einem Trenntrichter. Kombinieren Sie die drei organischen Extrakte und trocknen Sie über Natriumsulfit, reinigen Sie die Rohmischung durch Säulenchromatographie mit Kieselgel als stationäre Phase und dann 10%erhöhender Hexan-Ethylacetat-Gradient ab 100%Hexan und beenden mit 50 50%Hexan-Ethylacetat.
Zum Deprotection-Schritt 15 Milligramm des zuvor synthetisierten Produkts mit einer Pasteur-Pipette in ein 10 Milliliter-Reaktionsrohr geben und einen Magnetrührer hinzufügen. Fügen Sie zwei Milliliter wasserfreies Tetrahydrofuran mit einer fünf Milliliter Hamilton Spritze und füllen Sie das Rohr mit trockenem Stickstoff, um eine inerte Atmosphäre zu geben. Dann kühlen Sie die Lösung auf null Grad mit einem Eisbad.
Fügen Sie 150 Mikroliter tropfenweise von einer molaren Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in THF mit einer Hamilton-Spritze hinzu. Nach einer Stunde zwei Milliliter Wasser hinzufügen, um die Reaktion zu löschen. Extrahieren Sie die Lösung mit zwei Millilitern destillierten DCM dreimal mit einem Trenntrichter.
Kombinieren Sie die drei organischen Extrakte und trocknen Sie über Natriumsulfit. Für das Bleichverfahren Würmer auf gesäte sechs Zentimeter NGM-Platten drehen. Lassen Sie den Wurm von zwei bis drei Tagen wachsen, so dass es viele Eier und gravid Erwachsene auf dem Teller.
Sobald Sie viele Eier und Erwachsene haben, gießen Sie fünf Milliliter M9 auf den Teller. Mit einer Glaspipette die Würmer in ein 15 Milliliter Falkenrohr geben. Zentrifugieren Sie das Rohr für zwei Minuten bei 2.000 G und pellet die Würmer.
Saugen Sie den größten Teil des M9, ohne das Schneckenpellet zu stören. Fügen Sie drei Milliliter Bleichlösung hinzu und mischen Sie die Lösung vorsichtig, indem Sie etwa fünf Minuten invertieren oder bis Sie eine Abnahme der Anzahl intakter würmer sehen. Sobald sich die meisten Körper aufgelöst haben, zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 2.000 G.
Absaugen Sie den größten Teil der Bleichlösung, ohne das Schneckenpellet zu stören. 15 Milliliter M9 in die Röhre geben und gut mischen. Zentrifugieren Sie wieder bei 2.000 G für eine Minute.
Saugen Sie den größten Teil des M9, ohne das Schneckenpellet zu stören. Zur Herstellung von Schneckenproben ließen N2-Embryonen, die durch Bleichen erhalten wurden, über Nacht im M9-Puffer bei 20 Grad. Dann, Ernte synchronisiert L1s durch Zentrifugieren der Röhre zwei Minuten bei 2 000 G.Wash die Würmer mit M9 Puffer ein anderes Mal und quantifizieren die Anzahl der live L1. Samen etwa 10.000 Würmer in NGM-Platten mit einem Milliliter OP 50 Escherichia coli zuvor getrocknet.
Inkubieren Sie die Platten mindestens für 48 Stunden bei 20 Grad, bis die Würmer die L4-Stufe erreichen. Ernten Sie die Würmer mit kaltem M9-Puffer in einem 50 Milliliter Falkenrohr. Waschen Sie sie noch einmal und übertragen Sie sie in ein 1,5 Milliliter Rohr.
Pellet die Würmer durch Zentrifugation bei 2.000 G für eine Minute. Beseitigen Sie den größten Teil des Überstandes. Dann tauchen Sie die Röhre in flüssigen Stickstoff und rühren bei minus 80 Grad.
Etwa 100 Mikroliter gefrorene N2-Wurmpellets auftauen und dann 1,3 Milliliter Methanol hinzufügen. Danach die Probe vier Minuten lang beschallen. Nach der Beschallung 1 000 ppb des internen deuterated Standards, 2,6 Milliliter Chloroform und 1,3 Milliliter 0,5 Mol Kaliumchlorid, 0,08 Mol Phosphorsäure zu einem Endverhältnis von eins zu eins hinzufügen.
Wirbeln Sie die Proben für eine Minute und beschallen Sie sie dann in einem Ultraschall-Wasserbad für 15 Minuten auf Eis. Wirbeln Sie die Proben zweimal für eine Minute und zentrifugieren Sie sie für 10 Minuten bei 2.000 G, um eine Phasentrennung zu induzieren. Die untere Phase in ein sauberes Glasrohr einsammeln, unter Stickstoff trocknen und in 100 Mikroliter Acetonitril wieder aufhängen.
Um eine erfolgreiche Quantifizierung der endogenen 2-AG zu erreichen, war es notwendig, ihre gesättigte Analogie mit einer dreistufigen Methode zu synthetisieren. Anschließend wurde es Wurmproben hinzugefügt, extrahiert und analysiert durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, gekoppelt an Massenspektrometrie. Als interner Standard wurde die synthetisch deuterated 1-AG verwendet, um den endogenen Metaboliten zu quantifizieren.
Das Verfahren wurde mit den Übergängen für 2-AG und für deuterated 1-AG optimiert, bei denen Glyzerinmoleküle verloren gehen. 2-AG endogen aus den C.elegans Proben wurde erfolgreich nachgewiesen und durch Isotopverdünnung mit der chemisch synthetisierten deuterisierten 1-AG mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt an Massenspektrometrie quantifiziert. Probe eins wurde mit der deuterated Standard 1-AG hergestellt, während Probe zwei ohne Denstandard.
Da die ursprüngliche Konzentration des deutrated Standards in der Probe eins und drei bei jeweils 1 000 ppb lag, ist es aus dem Spitzenflächenverhältnis möglich, die endogene Konzentration von 2-AG in der Probe von 340 ppb für Probe eins und 360 ppb für Probe drei zu berechnen, was einem Durchschnitt von 350 ppb entspricht. Die Verhältnisse wurden als Qualität zwischen den Spitzenflächen von 2-AG bzw. deuterated 1-AG für zwei isolierte Proben berechnet. Beide mit dem deuterated Standard vor der Extraktion hinzugefügt.
Angesichts der kürzlich entdeckten Bedeutung der 2-AG für die Verbesserung des Cholesterinhandels und des Mangels an Informationen darüber, wie Lipide diesen Prozess beeinflussen, war es notwendig, eine zuverlässige Nachweismethode für dieses Endocannabinoid zu entwickeln. Die erfolgreiche Entwicklung einer einfachen und robusten synthetischen Methode, die hier berichtet wurde, um deuterated analog 2-AG zu erhalten, war ein wichtiger Schritt dieses Protokolls. Die meisten der gemeldeten Methoden zur Quantifizierung von Monoacylglycerolen beinhalten die Verwendung kommerziell verfügbarer analytischer Standards, die in der Regel teuer und instabil unter regelmäßigen Lagerungsbedingungen sind, was sie zu einem unerreichbaren für Laboratorien mit niedrigerem Budget macht.
Diese Methode löst dies jedoch, indem sie eine Synthese des Standards unter Verwendung leichter zugänglicher Ausgangsmaterialien vorschlägt. Die synthetische Methode ist geradlinig ohne ausgeklügelte Bedingungen erforderlich, so dass es ideal in jedem Labor mit minimaler Ausrüstung und Zugang zu Reaktanten durchgeführt werden, auch in einem reduzierten Budget. Zusammenfassend beschreibt dieses neue Verfahren eine geradlinige und reproduzierbare Art und Weise, 2-AG zu erkennen und zu quantifizieren, die helfen wird, einige der Fragen zu beantworten, die nach der Beschreibung der Rolle dieser Endocannabinoide beim Cholesterinhandel in C.elegans aufgeworfen wurden.
