Mechanische Eigenschaften von Pflanzenzellen sind unerlässlich, um bei dem Versuch, Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung zugrunde liegen, berücksichtigt zu werden. Die Atomkraftmikroskopie kann verwendet werden, um diese Eigenschaften zu messen und der Art und Weise zu folgen, wie sie sich zwischen Organen, Geweben, allen Entwicklungsstadien verändern. Die Hauptvorteile dieser Technik, ist, dass es keine invasive, ist es relativ schnell und es erfordert keine Behandlung, so dass es direkt auf lebende Proben angewendet werden kann.
Für jemanden, der neu in diesem Verfahren ist, ist cis Abschnitt der Probe wirklich kritisch, so stellen Sie sicher, dass Sie wirklich die richtige mechanische Fixierung der Probe haben. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, um die Feinheiten der Probenfixierung, Qualitätskontrolle der Pflegeeinrichtungen und der Messung besser zu verstehen. Demonstriert wird das Verfahren von Simone Bovio, einer Ingenieurin, und Yuchen Long, einem Postdoc in meinem Labor.
Um zu beginnen, legen Sie ein Stück doppelseitiges Band in die Mitte von fünf Zentimeter Durchmesser Petrischale. Fügen Sie dem Band eine Probe von Genesium hinzu, die von einer Blütenknospe isoliert wurde. Fügen Sie der Schale schnell Wasser hinzu, bis die Probe vollständig abgedeckt ist, um Eine Austrocknung zu vermeiden.
Legen Sie das Sample anschließend auf eine AFM-Stufe und bewegen Sie den Kopf so, dass er sich über der Probe befindet. Nachdem Sie den Ausleger in der Software kalibriert haben, stellen Sie sicher, dass sich das System im QI-Modus befindet, und nähern Sie sich der Probe mit einer Sollwertkraft von fünfzehn Nanonewtons. Als nächstes legen Sie eine Z-Länge von vier Mikrometern fest und legen Sie den Scanbereich auf achtzig mal achtzig Quadrate fest, wobei die Anzahl der Pixel auf vierzig bis vierzig festgelegt ist.
Gehen Sie dann zum erweiterten Imaging-Einstellungsfenster und stellen Sie den Modus auf konstante Geschwindigkeit ein. Darüber hinaus können Sie die Geschwindigkeiten der Spur auf zweihundert Mikrometer pro Sekunde und die Abtastrate auf 25 Kilo Hertz erweitern. Nachdem die Parameter festgelegt wurden, verschieben Sie die Spitze in den Bereich, der für die Stichprobe von Interesse ist.
Stellen Sie sicher, dass der zu scannende Bereich frei von Schmutz ist, suchen Sie einen bereich, der so flach wie möglich ist, und greifen Sie ein, beginnen Sie dann den Scan, und verwenden Sie den schnellen Scan mit niedriger Kraft, um zu überprüfen, ob sich die Probe bewegt. Sobald ein Bereich von Interesse gefunden wurde, wählen Sie eine Region, die vierzig von vierzig bis sechzig von sechzig Micron quadratisch ist, und erhöhen Sie die Pixelzahl auf zwei Pixel pro Mikron. Als nächstes erhöhen Sie den Sollwert auf fünfhundert Nano-Newton, um eine Einbuchtung von hundert bis zweihundert Nanometern zu erhalten.
Verringern Sie die Z-Länge auf zwei Mikrometer, und die Geschwindigkeiten des Ausdehnungstraktes werden auf hundert Mikrometer pro Sekunde erhöht, dann die Abtastrate auf fünfzig Kilohertz erhöht und mit dem Scannen der Probe begonnen. Wenn Sie fertig sind, speichern Sie die Ausgabe sowohl als Bild als auch als Datendatei. Öffnen Sie die Datenverarbeitungssoftware, und laden Sie die Datendatei.
Klicken Sie auf die Schaltfläche "Diese Karte verwenden für die Stapelverarbeitung", um die gleichen Parameter für alle Kurven der Karte zu verwenden, und fahren Sie dann zum Laden eines vordefinierten Prozesses und wählen Sie Hertz fit aus. Gehen Sie als Nächstes zum schaltbaren Basislinienbetrieb, und legen Sie Subtrahieren auf Offset plus Neigung und X min zwischen vierzig und sechzig Prozent fest. Wählen Sie auf der Registerkarte vertikale Spitzenposition auf glatt eng aus, wenn Sie lieber an Rohdaten arbeiten möchten.
Um das geeignete Anpassungsmodell auszuwählen, wechseln Sie zur Registerkarte Elastizitätsanpassung, und wählen Sie je nach erwarteter Haftfestigkeit eine der Optionen aus. Wenn keine oder schwache Haftung vorhanden ist, verwenden Sie die Annäherungskurve und ziehen Sie es vor, das Hertz-Isnader-Modell zu verwenden. Im Falle einer stärkeren Haftung, verwenden Sie das Modell von Dergen Milia Dortoprov oder DMD und arbeiten Sie an einer Verzögerungskurve.
Legen Sie nun die geometrischen Spitzenparameter basierend auf der nominalen Spitzenform fest. Die Spitze, die in diesem Experiment verwendet wird, ist eine kugelförmige Spitze mit einem Radius von vierhundert Nanometern. Legen Sie als Nächstes das Poisson-Verhältnis auf 0,5 fest, und wählen Sie Verschiebungskurven aus.
Fügen Sie eine zweite Elastizitätsanpassungsroutine hinzu, indem Sie auf das Symbol im Hauptfenster klicken, und wiederholen Sie die gleichen Parametereinstellungen. Geben Sie schließlich den gewünschten Einzug in X min an und gelten Sie auf alle, um die vorherigen Schritte auf allen Kurven der Karte zu durchlaufen. Speichern Sie die Ergebnisse, um ein Bild in einer Punkt-TSV-Datei zu erhalten.
Um mit schnellen Lösungsänderungen zu messen, montieren Sie eine Probe in eine Petrischale, halten Sie ein kleines Stück Klebemastix. Verschließen Sie den Spalt zwischen Mastix und Probenbasis schnell mit biokompatiblem Kleber. Warten Sie, bis der Kleber erstarrt ist, und tauchen Sie die Probe dann in ein flüssiges Spitzenkulturmedium, das 0,1 Prozent Pflanzenschutzgemisch enthält.
Öffnen Sie nach der Kalibrierung des Systems die Erfassungssoftware und gehen Sie zunächst zum Prüfparameterfenster. Dort wird die Federkonstante auf die gefertigte Federkonstante oder die ermittelte Federkonstante des Auslegers eingestellt. Als nächstes stellen Sie den Spitzenradius auf vierhundert Nanometer, das Proben-Poisson-Verhältnis auf 0,5, die Probenlinie auf einhundertachtundzwanzig, um eine schnelle Erfassung zu gewährleisten, die Scanrate auf 0,2 Hertz und die Scangröße auf ein Mikron.
Gehen Sie dann zum Rampenfenster und setzen Sie die Rampengröße auf fünf Mikrometer, die Trig-Schwelle auf maximal und die Anzahl der Proben auf viertausend sechshundertacht. Wenn alle Parameter festgelegt sind, nähern Sie sich der Probe sorgfältig manuell. Wenn sich die Sonde relativ nahe an der Probenoberfläche befindet, klicken Sie auf Denerk.
Nach Kontakt die Scangröße schrittweise erhöhen und die Scanrate ändern, bis ein gewünschtes Gleichgewicht erreicht ist, ohne die Probe oder die Spitze zu beschädigen. Verschieben Sie den Scan, wenn der Messbereich nicht wie gewünscht ist. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf die Schaltfläche, zeigen und schießen, um den Punkt zu initiieren und das Fenster zu schießen.
Geben Sie ein Speicherverzeichnis und einen Dateinamen an. Klicken Sie dann auf ramp auf nächsten Scan, um die Aufnahme zu initiieren. Wenn der Scan abgeschlossen ist, wird die Softwareschnittstelle zum Rampenfenster umgeleitet.
Klicken Sie auf das gescannte Bild, um die zu einrückenden Positionen anzugeben. Wählen Sie mindestens drei Einzugsanzeigen pro Zelle in der Nähe des Beerenzentrums aus, legen Sie fest, dass der Einzug dreimal pro Seite wiederholt wird, und klicken Sie dann auf Rampe und Erfassung. Öffnen Sie in der Analysesoftware die Dot-MCA-Datei, die die Position jeder Kraftkurve auf dem gescannten Bild anzeigt.
Öffnen Sie dann eine zu analysierende Kraftkurve. Klicken Sie auf die Schaltfläche für die Basislinienkorrektur, und ziehen Sie die blauen Strichlinien auf der Kraftkurve, bis Sie den Quellbasislinienstart verlängern und den Quellbasislinienstopp verlängern bzw. 0 Prozent bzw. 80 Prozent betragen. Klicken Sie dann auf ausführen.
Klicken Sie als nächstes auf die Schaltfläche Box Car Filter, und klicken Sie auf Ausführen, um die Kraftkurve zu glätten. Klicken Sie dann auf die Einzugsschaltfläche. Legen Sie im Eingabefenster die zu erweiternde aktive Kurve, die fünfte Methode auf linearisiertes Modell, die maximale Kraftanpassungsgrenze auf 99 Prozent, die Min-Kraft-Anpassungsgrenze auf 75 Prozent und das Anpassungsmodell auf Steifigkeit fest.
Analysieren Sie die Kraftkurven in einem Batch. Um dies zu erreichen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführungsverlauf", geben Sie das Berichtsverzeichnis an, und fügen Sie weitere Kraftkurven hinzu, die die gleiche Behandlung erfordern. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Ausführen.
Wenn der Wert für K batch angepasst ist, klicken Sie auf Verlauf, und wechseln Sie zu fünf Einzüge, um zum Einzugsfenster zurückzukehren. Wenn Sie dort sind, ändern Sie die maximale Kraftanpassungsgrenze auf zehn Prozent und die min-Kraft anpassungsgrenze auf ein Prozent. Stellen Sie dann das Anpassungsmodell auf Hertzian ein.
Öffnen Sie als Nächstes die entsprechende Datei, um die verschiedenen gescannten Kanäle anzuzeigen. Klicken Sie im Fenster mit dem hohen Kanal auf die Schaltfläche "Abschnitt". Dies ermöglicht die Messung der Probenoberflächenkrümmung, die für den Turgordruckabzug erforderlich ist.
Zeichnen Sie dann eine Linie über die lange Achse einer Zelle, verschieben Sie die Strichliniengrenzen an die Zellenkanten, und zeichnen Sie den Radiuswert auf. Folgen Sie schließlich im Textprotokoll, um den mittleren Jungmodul, die Federkonstante, E, K und den Turgordruck für jede Zelle zu berechnen. Das Bild auf der linken Seite ist eine Karte des Jungmoduls, die durch die Analyse des gesamten Einzugs bis zum benutzerdefinierten Kraftsollwert erhalten wird, während das Bild auf der rechten Seite das Ergebnis der Analyse der ersten hundert Nanometer Einzug zeigt.
Hier sehen die beiden Karten jedoch sehr ähnlich aus, die Variation der Einzugstiefe kann in einigen Fällen dazu führen, Stichprobenheterogenitäten besser hervorzuheben, was hilfreich sein kann, um den Standort zu identifizieren oder Informationen über das Verhalten interner Strukturen bereitzustellen. Für jeden Punkt auf diesen Karten gibt es eine zugrunde liegende Kraftkurve. Die hier gezeigte Kurve hat zwei Effekte, die erwähnenswert sind.
Zunächst einmal, wenn der Annäherungsteil der Kraftkurve bei fünfhundert Nanonewton endet. Die Abwärtsspitzenbewegung geht weiter. Das bedeutet, dass die letzte Kraft, die von der Spitze angewendet wird, höher ist als erwartet.
Die zweite Sache zu bemerken, ist die Welle in auf der Rückzugskurve durch die Ellipse hervorgehoben. Ein solches Winken kann ein Indikator für Probenseinwen sein, die sich unter der Wirkung der Spitze bewegen oder vibrieren, und es kann erforderlich sein, zu einer anderen Fixierungsmethode zu wechseln. Mit dem in diesem Artikel beschriebenen Verfahren können alle wichtigen Parameter für einen Turgordruckabzug mit Ausnahme der Zellwanddicke aus AFM-Scans und Einzügen abgerufen werden.
Die Kraftkurve des tiefen Einzugs an der Rotkreuzposition beschreibt den Modul der Zellwandjungundung und die scheinbare Steifigkeit der Probe bei verschiedenen Regimen der Kurve. Die Probenfixierung ist von entscheidender Bedeutung. Achten Sie während des Messvorgangs auf Anzeichen von Probeninstabilität.
Wählen Sie sorgfältig eine Region mit flacher Oberfläche aus, um eine senkrechte Einrückung zu gewährleisten. Nach diesem Verfahren kann man mechanische Eigenschaften im Laufe der Zeit und verschiedene Bedingungen überwachen. Man kann auch mechanische Messungen mit konfokalen Bildern für korrelative Studien überlagern.
Diese Technik ebnet den Weg für die Verknüpfung von Biomechanik mit physiologen der Entwicklung und anderen biologischen Prozessen.
