Die Methode ist signifikant, weil sie neurochemische Detektion mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht, die potenziell in vivo Methoden der neurochemischen Detektion verbessern kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es eine schnelle, einfache und reproduzierbare Methode ist, um die Empfindlichkeit und zeitliche Auflösung der Neurotransmitter-Erkennung zu verbessern. Demonstriert wird das Verfahren von Sanuja Mohanaraj und Pauline Wonnenberg, Absolventen meines Labors.
Zunächst trennen Sie Kohlefasermaterial in einzelne Stränge und ziehen Sie eine einzelne Sieben-Mikrometer-Carbonfaser aus einem Strang. Schließen Sie eine Vakuumleitung an eine Borosilikatglaskapillare an und saugen Sie die Kohlefaser in die Kapillare. Dann schneiden Sie ein 10-Zentimeter-und 25-Zentimeter-Stück Karton als Elektrodenhalter dienen.
Kleben Sie ein Papiertuch als Stütze um die Pappe, legen Sie die Kapillare in den Elektrodenhalter ein und befestigen Sie sie vorsichtig in einem vertikalen Kapillarzieher. Konfigurieren Sie den Kapillarzieher, um die Glaskapillare zu einer feinen Verjüngung für Elektrodenmaterialien zu ziehen und zu starten. Sobald das Ziehen beendet ist und die Heizspule abgekühlt ist, schneiden Sie die Kohlefaser, die die rohrgezogenen Elektroden verbindet.
Entfernen Sie vorsichtig die Mikroelektroden aus dem Kapillarzieher. Mit einer scharfen Klinge oder einer chirurgischen Schere, die die hervorstehende Kohlefaser an jeder Elektrode auf etwa 100 bis 150 Mikrometer Länge trimmt, indem Sie sie von einem Stereoskop oder Mikroskop leiten. Als nächstes, in einer 25-Milliliter-Durchstechflasche, verwenden Sie einen Wattestäbchen, um 10 Gramm Epoxid mit 0,2 Milliliter härter zu mischen.
Füllen Sie eine weitere Durchstechflasche mit Aceton. Für jede Elektrode die Kohlefaserspitze 15 Sekunden lang in Epoxid eintauchen und dann drei Sekunden lang in Aceton tauchen, um überschüssiges Epoxid zu entfernen. Nach dem Epoxying werden die epoxied Elektroden dann im Ofen für drei Stunden bei 125 Grad Celsius ausgehärtet.
Als nächstes verwenden Sie einen Mikromanipulator, um eine Kohlefaser-Mikroelektrode in eine Silber-Silber-Chlorid-Referenzelektrode in einer 0,5-Millimolar-Lösung aus Chlorauurinsäure in 0,1 molares wässriges Kaliumchlorid zu platzieren. Verbinden Sie die Elektroden mit einer Carbonfaser-Mikroelektrode als Arbeitselektrode an einen Potentiostat. Scannen Sie die Elektrode von 0,2 Volt auf minus einen Volt bei 50 Millivolt pro Sekunde für 10 Zyklen, um die Elektrodenabscheidung durchzuführen.
Es ist wichtig, die Parameter für die Ablagerung der Goldbeschichtung zu optimieren. Zu viel Beschichtung verursacht Lärm und Signalüberlastung, während zu wenig Beschichtung die neurochemische Erkennung nicht verbessert. Bereiten Sie vor dem Test eine 10-Millimolar-Stammlösung von Dopamin in Perchlorsäure und etwa einen Liter pH 7,4 PBS-basierten Puffer in entionisiertem Wasser vor.
Pipette einen Mikroliter der Dopamin-Stammlösung in 10 Milliliter Puffer, um eine etwa eine Mikromolar Dopamin-Lösung zu machen. Dann verbinden Sie eine Kohlefaser-Mikroelektrode und eine Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode mit einem Potentiostat. Fixieren Sie die Kohlefaserelektrode und die Referenzelektrode in der Kopfstufe des Durchflusszellengeräts und verwenden Sie den Mikromanipulator, um sie in die Durchflusszelle zu senken.
Zeichnen Sie 60 Milliliter des PBS-Puffers in eine Spritze. Füllen Sie die Durchflusszelle mit Puffer, und montieren Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe. Beginnen Sie mit einer Rate von einem Milliliter pro Minute mit dem Fließen des Puffers durch die Durchflusszelle.
Konfigurieren Sie dann den Potentiostat so, dass er für minus 0,4 Volt bis 1,3 Volt bei 10 Hertz und 400 Volt pro Sekunde scannt. Tragen Sie die Wellenform kurz auf die Mikroelektrode auf, beobachten Sie das Oszilloskop und passen Sie die Verstärkung an, um eine Überlastung zu vermeiden. Lassen Sie die Mikroelektrode 10 Minuten im Puffer aussetzen.
Ziehen Sie dann die verdünnte Dopaminlösung in eine Spritze und verbinden Sie sie mit dem Injektionsanschluss der Durchflusszelle. Stellen Sie die Gesamtlaufzeit auf dem Potentiostat auf 30 Sekunden ein. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Messungen, warten Sie 10 Sekunden und injizieren Sie dann 0,2 Milliliter Dopaminlösung in die Durchflusszelle.
Wenn der Lauf abgeschlossen ist, verarbeiten Sie die Daten mit einer hochauflösenden zyklischen Voltammetrieanalysesoftware. Lassen Sie die Mikroelektrode 10 Minuten lang wieder ausduquirieren, bevor Sie einen weiteren Test durchführen. Wenn die Tests abgeschlossen sind, reinigen Sie die Durchflusszelle, indem Sie dreimal drei Milliliter Wasser und drei Milliliter Luft in den Puffer- und Injektionsanschluss injizieren.
Beschichtete Kohlefasern wurden mit Rasterelektronenmikroskopie abgebildet. Die Dicke und Partikelgröße der Gold-Nanopartikelbeschichtungen kann durch die Abscheidungszeit der Elektroden gesteuert werden. 20 Minuten Elektrodenablagerung ergaben eine dicke Goldbeschichtung mit scharfen Graten, während fünf Minuten zu einer dünnen gleichmäßigen Goldbeschichtung führten.
Gold nanopartikelbeschichtete Kohlenstofffaser-Mikroelektroden hatten deutlich höhere oxidative Spitzenströme und eine schnellere Elektronentransferkinetik als unveränderte Elektroden. Die Gold-Nanopartikelbeschichtung hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Stabilität der Elektrodenreaktionen, wie hier in einer Dopaminlösung nachgewiesen wurde. Sowohl nackte als auch goldfarbene nanopartikelbeschichtete Elektroden reagierten linear auf Scanratenänderungen mit einer viel größeren Veränderungsgröße der goldbeschichteten Elektroden.
Dies deutete darauf hin, dass die Dopamin-Absorption über die Scanrate gesteuert werden konnte. Sowohl nackte als auch goldnanopartikelbeschichtete Elektroden reagierten linear zwischen Dopaminkonzentrationen von 100 Nanomolar bis 10 Mikromolar. Eine asymptotische Kurve wurde bei höheren Konzentrationen beobachtet, was darauf hindeutet, dass Dopamin an der Elektrodenoberfläche übersättigt ist.
Die Fähigkeit, neurochemische Veränderungen auf einer schnelleren Zeitskala und bei höheren Empfindlichkeiten zu erkennen, wird helfen, komplexe Fragen in der Neurowissenschaft zu beantworten. Diese Methode wird auch in der analytischen Chemie, Metabolomik und Umweltwissenschaft verwendet. Während es leicht zu erlernen ist, ist visuelle Demonstration entscheidend für das Lernen, die Mikroelektroden herzustellen, zu modifizieren und zu testen.
Zukünftige Richtungen für diese Methode umfassen die Anpassung der Ablagerung von Gold und anderen Beschichtungen, um Dicke, Größe, Form und Morphologie zu berücksichtigen, um den Nachweis bestimmter Neurotransmitter zu optimieren. Forscher sollten den Umgang mit kleinen Fasern unter dem Mikroskop üben, bevor sie diese Technik ausprobieren. Auch, Neurotransmitter-Stammlösung sollte in einer Rauchhaube vorbereitet werden, weil sie 1 Molar Perchlorsäure verwenden.
