Der ddTRAP-Assay bietet die Möglichkeit, eine empfindliche, robuste und hochquantitative Messung der telomerase-enzymatischen Aktivität in Zellen zu erhalten. Die Möglichkeit, bis zu 96 Samples pro Durchlauf mitteldurchsatzweise zu laufen, bietet uns einen großen Vorteil. Wir können die Steuerelemente und Replikationen für eine ordnungsgemäße statistische Analyse der gesammelten Daten ausführen.
Unmittelbar vor der Zelllysierung einen gefrorenen Aliquot von NP-40-Lysepuffer auftauen. Nach dem Auftauen den Lysepuffer auf Eis legen. Fügen Sie dem NP-40-Lysepuffer einen PMSF-Protease-Inhibitor hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2 Millimolar zu erreichen.
Fügen Sie dann 40 Mikroliter des Lysepuffers in die Röhre ein, die ein Zellpellet enthält, um eine Zelläquivalenz von 25 000 Zellen pro Mikroliter zu erreichen. Das Lysat nach oben und unten sanft pipette, um die Zellen aufzubrechen. Versuchen Sie, Blasen zu vermeiden.
Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis lysieren. Mischen Sie das Lysat alle 10 Minuten sanft, um die Bildung von Zellabfallhaufen zu verhindern. Während der Zelllyse eine Mastermischung in einem Mikrozentrifugenrohr für die Telomerase-Verlängerungsreaktion vorbereiten und auf Eis lagern.
Nach der Zelllyse mischen sich Pipette 48 Mikroliter Verlängerungsmaster in jedes PCR-Rohr. Fügen Sie zwei Mikroliter verdünntes Lysat zu jedem PCR-Röhrchen hinzu, um eine endgültige Zelläquivalenz von 50 Zellen pro Mikroliter zu erreichen, und setzen Sie die Telomerase-Erweiterungsreaktion entsprechend dem Manuskript fort. Bereiten Sie eine Master-Mischung in einem Mikrozentrifugenrohr für den ddTRAP vor und halten Sie ihn bei Raumtemperatur.
Pipette 19,8 Mikroliter ddPCR Master-Mix in jedes PCR-Rohr. Fügen Sie 2,2 Mikroliter der vorherigen Verlängerungsreaktionslösung zu jeder Röhre hinzu, so dass ein Gesamtvolumen von 22 Mikrolitern übrig bleibt. Um die Tröpfchen-Generierungspatrone einzurichten, laden Sie zunächst 20 Mikroliter der vorbereiteten Lösung gut in die mittlere Probe gut in die Patrone.
Tippen Sie vorsichtig auf die Seite der Patrone, um Blasen an die Oberseite der Lösung zu bewegen. Alle Brunnen der Patrone müssen vor dem Verladen des Öls mit Probe beladen werden. Dann 70 Mikroliter Tröpfchen-Erzeugungsöl in den linken Ölbrunnen laden.
Sichern Sie die Dichtung an Ort und Stelle, indem Sie sie an die Enden der Patrone kleben, und legen Sie die geladene und montierte Patrone in den Tröpfchengenerator. Der Generator zeigt ein durchgehendes grünes Licht an, um die korrekt platzierte Patrone mitzuteilen. Nach 60 bis 90 Sekunden, wenn das Generatorlicht nicht mehr blinkt, ist der Zyklus abgeschlossen.
Entfernen Sie nun die Patrone. Entfernen Sie die Dichtung vorsichtig aus der Patrone. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um ca. 40 Mikroliter der neu erzeugten Tröpfchen von rechts in eine 96-Well-PCR-Platte zu pipette.
Wärmen Sie die Platte mit Aluminiumfolie PCR-Plattendichtungen, sobald alle Proben in der 96-Well-Platte geladen sind, um Verdunstung zu verhindern. Dann laden Sie die 96-Well-Platte in einen Thermocycler, um die PCR-Reaktion durchzuführen. Laden Sie zunächst die 96-Well-Platte in den Tröpfchenleser.
Richten Sie die Platte richtig aus, so dass die A1-Probe mit der des Halters übereinstimmt. Öffnen Sie die Software, die dem Tröpfchenleser zugeordnet ist. Doppelklicken Sie auf den ersten Brunnen, A01, um den Beispiel-Gut-Editor-Bildschirm zu öffnen.
Klicken Sie auf Experimentieren, und wählen Sie den Typ des Assays aus, der im Dropdown-Menü verwendet werden soll. Wählen Sie QX200 ddPCR EvaGreen Supermix als korrekte Erkennungsmethode aus. Klicken Sie auf Anwenden in der unteren rechten Seite des Gut-Editor-Bildschirms, um die benutzerdefinierten Einstellungen in allen hervorgehobenen Brunnen zu speichern.
Klicken Sie als Nächstes im Gut-Editor-Bildschirm auf Ziel, und klicken Sie auf das Dropdown-Menü Ziel, um entweder unbekanntes, Referenz- oder Vorlagensteuerelement auszuwählen, um den Typ des Beispiels zu definieren. Beschriften Sie im Abschnitt Beispielname alle Beispiele, und klicken Sie auf Anwenden. Klicken Sie auf Ausführen, um das Kennzeichen zu lesen.
Wählen Sie entweder Spalten oder Zeilen im Bildschirm Ausführungsoptionen aus, wenn Sie aufgefordert werden, über die Ausrichtung der Platte zu informieren. Bestimmen Sie die Anzahl der akzeptierten Tröpfchen für jede Probe, indem Sie auf die einzelnen Brunnen oder Spalten- und Zeilenüberschriften doppelklicken, um eine Tabelle mit Informationen bereitzustellen. Für den ddTRAP gelten Proben mit 10.000 oder mehr akzeptierten Tröpfchen für die weitere Analyse.
Markieren Sie die Bohrungen, die Beispielreplikationen und NTC-Beispiele darstellen. Legen Sie den Schwellenwert für die Beispiele manuell fest, indem Sie auf das Symbol zum Festlegen von Schwellenwerten unten links auf dem Bildschirm klicken. In diesem Protokoll wurde die Telomeraseaktivität in einem Zellpanel gemessen, das aus neun Zelllinien von Lungenkrebs und Telomerase-negativen Fibroblasten besteht.
Für alle drei biologischen Replikationen für SHP77, H2887 und NTC wurde ein Schwellenwert von etwa 2 000 Fluoreszenzamplitude festgelegt. Positive Tröpfchen hatten eine Fluoreszenzintensität von etwa 6 000 Fluoreszenzamplitude, die eine klare Population an der Spitze bildete und von negativen Tröpfchen um 1,100 Fluoreszenzamplitude getrennt war. Die gesamten Telomerase-Erweiterungsprodukte pro Zelläquivalent zwischen allen Proben wurden anhand der gemessenen Konzentration der Nukleinsäuren geschätzt, die die Telomerase-Aktivität in Lungenkrebslinien darstellt.
Jede RNase-Kontamination während der Lyse- oder Verlängerungsreaktionsschritte zerstört die enzymatische Aktivität von Telomerase, da es sich um einen Ribonukleoprotein-Komplex handelt. ddTRAP kann mit ddPCR auf hTERT mRNA-Expressionsebenen in der Zelle verfolgt werden. Die beiden Datensätze ermöglichen es uns, den Ausdruck von hTERT mit telomerase Aktivität zu korrelieren und tiefer in mögliche Telomerase-Regulierungsmechanismen wie alternatives Spleißen einzutauchen.
Wir können Manipulationen zu bestimmten Spleißfaktoren und deren Auswirkungen auf die Telomerase-Aktivität untersuchen. Derzeit entwickeln wir Oligonukleotid-Spleißmodulatoren als potenzielle Medikamente, die auf Telomerase-Aktivität abzielen.
