Dieses Protokoll wird Forschern helfen, eine neue Art von Mausmodell zu generieren, um die Entwicklung von menschlichem Brustkrebs aus verschiedenen Teilmengen von Brustepithelzellen zu rekapitulieren. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Brustkrebs-Maus-Modelle im Entwicklungsstadium Gewebe auf eine zelltypspezifische Weise und ohne die Notwendigkeit einer umfangreichen Mauszucht zu generieren. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, generieren, warten und anästhesieren Sie floxierte Mäuse, wie im Textprotokoll beschrieben.
Bringen Sie die Maus in einen Bereich, der von dem Ort getrennt ist, an dem die Operation durchgeführt werden soll. Nach Bestätigung der Anästhesie durch Durchführung einer Zehenprise, injizieren Meloxicam als Analgesie subkutan in einer Dosis von fünf Milligramm pro Kilogramm, um für den chirurgischen Eingriff vorzubereiten. Setzen Sie die Brustwarzen chirurgische Stelle durch die Anwendung mehrerer Tropfen Haarentfernung Creme.
Entfernen Sie übermäßige Creme und lockeres Haar mit weichen Papiertüchern. Rasieren wird nicht empfohlen, um Schäden an den Brustwarzen zu vermeiden. Desinfizieren Sie die chirurgische Stelle mit Iodophoren zuerst gefolgt von 70%Alkohol und enden mit einer endgültigen Anwendung von Peeling-Iodophoren.
Tun Sie dies in einer kreisförmigen Bewegung von der Mitte des Arbeitsbereichs in Richtung Peripherie mit einem Gazeschwamm oder einem Baumwoll-Applikator. Wiederholen Sie den Zyklus drei- bis viermal. Verwenden Sie aseptische Techniken während des gesamten chirurgischen Eingriffs.
Machen Sie eine Einschnittstelle auf der Haut mit einer Länge von etwa einem Zentimeter zwischen den beiden vierten Leistenbrustdrüsen. Trennen Sie vorsichtig die Hautklappe vom parietalen Peritoneum, um den Brustduktalbaum zu sehen. Halten Sie die Brustwarze vorsichtig mit Uhrmacherzangen, um die Außennippel zu entfernen, ohne die nahe gelegene Haut mit einer Mikrodissektionsschere zu schneiden.
Laden Sie etwa drei bis fünf Mikroliter Cre-adenovirus Injektionsmischung in eine 25 Mikroliter Hamilton Spritze mit einer 33 Gauge Metallnabennadel befestigt. Schätzen Sie das Volumen der Injektionsmischung in der Spritze auf der Grundlage des in der Mischung enthaltenen blauen Farbstoffs. Halten Sie vorsichtig den Rand der Hautklappe mit einer feinen gekrümmten Pinzette und injizieren Sie die Cre-adenovirus Injektionsmischung langsam in die Brustwarze, während Sie die Ausbreitung von blauem Farbstoff in den Brustduktalbaum überwachen.
Halten Sie die Injektionsrate so langsam wie möglich, um Schäden am duktalen Lumen zu vermeiden. Eine erfolgreiche intrauktale Injektion wird durch injizierte Flüssigkeiten angezeigt, die sich über den gesamten duktalen Baum ausbreiten, ohne in das Stroma-Fach zu gelangen. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus der Brustwarze, um ein Auslaufen der injizierten Flüssigkeit zu vermeiden.
Untersuchen Sie die distale Seite der Brustdrüse oder die Umgebung der injizierten Brustwarze. Farbstoff, der in die nahe gelegene Stroma diffundiert, wie hier gezeigt, deutet eher auf eine Brustfettpad-Injektion als auf eine erfolgreiche intrauktale Injektion hin. Schließen Sie die chirurgischen Wunden in der Haut mit Wundclips.
Entfernen Sie die Maus von der Anästhesie und legen Sie sie auf ein Heizkissen in einem sauberen Käfig für die Erholung. Überwachen Sie die Entwicklung des Brusttumors, wie im Textprotokoll beschrieben. Die jüngsten weiblichen Mäuse, bei denen eine intrauktale Injektion erfolgreich durchgeführt werden kann, sind die im Alter von etwa drei Wochen.
Obwohl für die meisten Mammary Tumor Induktionsexperimente, junge erwachsene weibliche Mäuse verwendet werden. Intraduktionale Injektion mit einem größeren Volumen der Injektionsmischung kann bei weiblichen Mäusen während der frühen bis mittleren Trächtigkeit durchgeführt werden, um alveolare Zellen anzugreifen. Um verschiedene Brustepithelzellsubpopulationen für die Brusttumorinduktion ins Visier zu nehmen, wurden Cre-adenoviren unter der Kontrolle verschiedener Brustepithelzellsubmenge spezifische Promotoren für die Injektion verwendet.
Zum Beispiel wurde das Cre-adenovirus unter der Kontrolle von Keratin 8-Promotor verwendet, um luminale Brustepithelzellen anzugreifen. Das Cre-adenovirus unter der Kontrolle von Keratin 5-Promotor zielte auf die Basallinie, die zur genetischen Markierung nur von Basal-Epithelzellen führte. Bei einer weiblichen P53-Flox-Homozygoten-Maus mit einem ROSA26-YFP-Reporter führte die intrauktale Injektion von Keratin 8 Cre-adenovirus einige Monate nach der Injektion zur Entwicklung von Brusttumoren.
Durch die Einbeziehung des bedingten R26-Y-Reporters wurden Tumorepithelzellen typischerweise durch YFP markiert und konnten durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Die Zellen können durch die Flusssortierung von YFP-positiven Zellen zur weiteren Analyse angereichert werden. Die wichtigsten Dinge, die Sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, sind, ein kleines Injektionsvolumen zu verwenden, langsam zu injizieren und auch die Nadel langsam zurückzuziehen.
Nach diesem Verfahren kann man das Fortschreiten der gezielten YFP-positiven Epithelzellen zu prämalignen und Krebsstadien durch Durchflusszytometrie oder Co-Immunfluoreszenzfärbung der injizierten Drüse überwachen. Diese Technik wird den Forschern den Weg ebnen, um Zellen mit Ursprung von Brustkrebs zu untersuchen, wie sie auf verschiedene autogene Ereignisse reagieren und wie sie zu Krebszellen übergehen. Sowohl Adenovirus als auch die Injektionsnadel sind potenziell gefährlich.
Daher sollte man bei der intrauktinalen Injektion immer Handschuhe tragen und Sicherheitsnadeln und Spritzen verwenden.
