Durch die abteilungalisierten mikrofluidischen Geräte können Neuronen in ihrer stark polarisierten Form untersucht werden. Diese Geräte sind sowohl für die grundlagende als auch für die translationale neurowissenschaftliche Forschung von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt, wie zyklische Olefin-Copolymerchips verwendet werden, um Neuronen zu unterteilen, die sich von menschlichen Stammzellen unterscheiden.
Diese COC-Chips produzieren gesündere Kulturen differenzierter Neuronen gegenüber PDMS-Multi-Kompartienten-Geräten. In diesem Protokoll zeigen wir die Kultur der Neuronen, die sich von der NIH-zugelassenen H9-Stammzelllinie unterscheidet. Ähnliche Verfahren können verwendet werden, um Neuronen von mIPSCs zu unterscheiden.
Die Multi-Fach-Chips müssen mit zusätzlicher Befeuchtung in sekundäre Containment-Anlagen gelegt werden. Die Kanäle der Multi-Compartment-Chips müssen mit einer Vorbeschichtungslösung gefüllt und dann mit PBS gespült werden. Um zu beginnen, lösen Sie Poly-L-Ornithin in Zellkultur Grade destilliertes Wasser, um 600 Mikroliter Lösung pro Chip zu machen.
Saugen Sie die restlichen PBS aus den Brunnen, um sicherzustellen, dass die Pipettenspitze von der Kanalöffnung entfernt ist. 150 Mikroliter Poly-L-Ornithin-Arbeitslösung in den oberen rechten Brunnen laden. Warten Sie 90 Sekunden und fügen Sie 150 Mikroliter der Lösung auf den unteren rechten Brunnen.
Warten Sie fünf Minuten und wiederholen Sie den Ladevorgang mit der Lösung für die linken Bohrungen. Dann legen Sie das Luftbefeuchtertablett mit Chip bei vier Grad Celsius über Nacht. Wenn Sie eine Petrischale verwenden, wickeln Sie sie mit Parafilm ein und legen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius ab.
Als nächstes die Lösung aus den Brunnen ansaugen, um sicherzustellen, dass die Pipettenspitze von der Kanalöffnung weg platziert wird. Und wiederholen Sie das Beladen der rechten und linken Brunnen mit 150 Mikroliter n.V. sterilem Wasser zweimal. Bereiten Sie die Laminin-Arbeitslösung vor.
Laden Sie die rechten und linken Brunnen mit 150 Mikrolitern jeder der Laminin-Arbeitslösung. Inkubieren Sie den Chip innerhalb des Tabletts für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie den Chip mit PBS ohne Kalzium und Magnesium.
Laden Sie die rechte und die linke Bohrung mit je 150 Mikroliter PBS. Warten Sie fünf Minuten. Aspirieren Sie die PBS aus den Brunnen und spülen Sie den Chip mit NSC-Medien.
Laden Sie die rechte und linke Bohrung mit je 150 Mikrolitern der NSC-Medien. Inkubieren Sie den Chip in der Schale über Nacht im 37 Grad Celsius Inkubator mit 5%CO2, um den Chip vorzukonditionieren. Um menschliche neuronale Stammzellen in den Multi-Kompartiment-Chip zu säen, zählen Sie zunächst die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer.
Dann, aspirieren Sie die Medien aus den Brunnen. Pipette fünf Mikroliter der Zelllösung bis zum oberen rechten Brunnen, gefolgt von fünf Mikrolitern zum unteren rechten Brunnen. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu überprüfen, ob Zellen in den Kanal eingedrungen sind.
Warten Sie fünf Minuten, bis die Zellen an der Unterseite des Chips haften. Pipette ca. 150 Mikroliter NSC-Medien rechts und links. Inkubieren Sie bei 5%CO2, 37 Grad Celsius in einem geeigneten befeuchteten Behälter.
Nach 48 Stunden, aspirieren NSC-Medien aus den Brunnen und ersetzen Sie es durch neuronale Differenzierung Szenieren Medien durch Zugabe von 150 Mikroliter zu jedem oberen Brunnen und jedem Boden gut. Kulturneuronen innerhalb eines 5%CO2, 37 Grad Celsius Inkubator in einem Luftbefeuchter Tablett. Entfernen Sie die verbleibenden neuronalen Differenzierungsmedien aus dem axonalen Fach und legen Sie es in ein Zentrifugenrohr.
Bei 37 Grad Celsius lagern. Mischen Sie 50 Mikroliter der Viruslösung mit 150 Mikrolitern der erwärmten Medien. Pipette 100 Mikroliter der Mischung zu beiden Brunnen des Axonfachs.
Inkubieren Sie für zwei Stunden innerhalb eines 37 Grad Celsius Inkubator. Zurückziehen und virushaltige Medien entsorgen. 75 Mikroliter der Frischmedien vorsichtig auf ein Axonfach gut pipette und die Medien durch den Kanal in ein anderes Axon gut fließen lassen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal. Füllen Sie schließlich das Axonfach mit dem gespeicherten Medium, und übertragen Sie den Chip auf den Inkubator. Nach einer Woche im Chip mit den Differenzierungsmedien differenzierten sich menschliche neuronale Stammzellen in Neuronen, die im somatischen Fach gleichmäßig befestigt und verteilt wurden.
Im Vergleich dazu aggregierten Sichmen in PDMS-Geräten bereits fünf Tage nach der Zugabe von Differenzierungsmedien, was zu einer beeinträchtigten Zellgesundheit führte. Die Visualisierung von markierten Neuronen und dendritischen Stacheln mit mCherry fluoreszierendem Protein zeigte, dass NSC-abgeleitete Neuronen, die innerhalb der Chips differenziert sind, reife Synapsen bilden. Neuronen wurden für den exzitatorischen synaptischen Marker vGlut1 gekennzeichnet.
Immunostaining Ergebnisse zeigen, dass viral markierte Neuronen mit vGlut1 kolokalisieren könnten, und neuron-spezifische Marker, Beta-Tubulin drei. Viral transduzierte mCherry-Neuronen erweitern Projektionen in eine axonlokalisierte Mikroumgebung, die innerhalb des vormontierten Chips eingerichtet ist. Ein Vergleich zwischen den Bildern von mCherry beschrifteten Neuronen vor und unmittelbar nach der Axotomie zeigte vollständig abgetrennte Axone.
Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Kanäle mit Flüssigkeit gefüllt bleiben, außer bei der Durchführung der Axotomie-Verfahren. COC-kompartalisierte Chips sind einfach zu bedienen und können die Tür für zahlreiche Untersuchungen im Zusammenhang mit neuronalen Verletzungen, Synaptogenese, synaptische Plastizität und Pathophysiologie der Krankheit öffnen.
