Virale Vektoren können genetisches Material in Zellen einführen, um defekte Gene zu kompensieren, wichtige Wachstumsproteine hochzuregulieren oder Marker herzustellen, die neuronale Schaltkreise verfolgen können. Die Einführung viraler Vektoren in das Nervensystem ist aufgrund angeborener biologischer Barrieren eine Herausforderung. Die direkte Injektion in das Rückenmarksgewebe umgeht diese Barrieren und ermöglicht den Zugang zu Zellkörpern oder Synapsen.
Die richtige Ausrichtung der Wirbelsäulenwerte L1 bis L4 kann schwierig sein. Es ist wichtig, Markierungen zu verwenden, um das Ziel zu überprüfen und daran zu denken, dass diese Segmente zu den Wirbeln T11 bis T13 führen. Stecken Sie am Tag des Eingriffs den Injektor in die Mikropumpe und legen Sie die Mikropumpe in einen Mikromanipulator mit einer Vernierskala.
Verwenden Sie eine Spritze mit einer flexiblen Nadel, um einen farbigen Farbstoff vorsichtig in eine der Glasnadeln zu laden und die Glasnadel in den Injektor einzufügen. Bestätigen Sie dann, dass die Nadel korrekt in die Unterlegscheiben gesät ist und dass die Injektorkappe fest geschraubt ist und dass die Stahlinjektornadel etwa drei Viertel der Länge der Glasnadel verlängert wird. Vor Beginn des Verfahrens mindestens einen Mikroliter auftauen, plus ein kleines Volumen an zusätzlichem Virus pro Injektion aus der Gefrierlagerung, und bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion von Zehenkneifen in einer anästhesierten Ratte.
Rasieren Sie entlang der dorsalen Mittellinie von den Hüften bis zum unteren Winkel des Schulterblattes des Tieres, ziehen Sie die Haut straff für eine einfachere und präzisere Rasur, und desinfizieren Sie die exponierte Haut mit sequentiellen 5%Jod und 70%Ethanol Peelings. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf. Dann legen Sie das Tier auf ein steriles Tuch und legen Sie Gaze unter die Blase, um jeden Urin zu sammeln.
Um die Stelle des Hautschnitts zu identifizieren, drücken Sie die Finger sanft an der letzten Rippe, um den L1-Wirbel zu lokalisieren. Verwenden Sie diesen Wirbel als Meilenstein und halten Sie die Haut straff durch sanfteS Ausbreiten beim festdrücken mit dem Skalpell, verwenden Sie eine Nummer 10 chirurgische Klinge, um eine drei bis vier Zentimeter gehäutete Schnittzuschnitt endet nur unter L1, um den Muskel zu belichten. Verwenden Sie Zangen und Scheren, um für die spinösen Prozesse zu fühlen.
Machen Sie kleine rostrale Schnitte, damit Sie Platz für einen sicheren Prozess mit Rattenzahnzangen schaffen. Und machen Sie zwei lange, tiefe Schnitte so nah wie möglich an den Prozessen. Nach der Sicherung der seitlichen Muskeln an Ort und Stelle, löschen Sie den Muskel um die Prozesse, um die Form ihrer Köpfe zu bestimmen.
Dann visualisieren Sie die Formen der Köpfe der spinösen Prozesse, um die Laminektomie-Site zu identifizieren. Die Prozesse T11 und T12 und T13 werden der Standort der Laminektomie sein. Sobald der Zielbereich korrekt identifiziert wurde, verteilen Sie vorsichtig die Wirbel, um die Bande zu offenbaren, und verwenden Sie Rongeurs, um kleine Bisse der spinlösen Prozesse und den dorsalen Aspekt der Wirbel zu nehmen.
Reinigen Sie den Knochen von der Mittellinie weg, so dass das Mittellinienblutgefäß beobachtet werden kann, so dass ein Fenster zurückbleibt, das das Rückenmarksgewebe deutlich offenbart und frei von Schmutz ist. Dann befestigen stabilisierende Zangen an den spinalen Prozessen rostral und kaudal an der Laminektomie Fenster, um das Tier in einem Wirbelsäulenhalter zu sichern. Und heben Sie den Bauch des Tieres, um die Wirkung von Atembewegungen zu negieren.
Um das Virus in den Injektor zu laden, pipette etwa fünf Mikroliter des aufgetauten Lagers auf ein Stück Parafilm, und positionieren Sie die Glasnadeln, so dass die Spitze im Tropfen ist. Verwenden Sie die Mikropumpe, um bis zu vier Mikroliter Virus mit einer Rate von 20 bis 100 Nanoliter pro Sekunde abzuziehen, und stellen Sie den Controller so ein, dass er injiziert wird, bevor er eine kleine Menge Virus aus der Nadelspitze freisetzt, um sicherzustellen, dass er nicht blockiert wird. Wischen Sie überschüssige Viren mit einem Laborwisch ab und positionieren Sie die Mikromanipulatoren so, dass die Vernier-Skala sichtbar ist.
Legen Sie die Nadel an die Mittellinie des Rückenmarks, und verwenden Sie die Vernier-Skala auf dem Mikromanipulator, um die Nadel seitlich 0,8 Millimeter zu lenken. Dann senken Sie die Nadel auf den Spinalakkord, bis es einrückend ist, aber nicht punktierend, die Dura, und verwenden Sie eine schnelle Drehbewegung, um die Dura mit der Nadel zu punktieren, bis die Nadelspitze auf eine Tiefe von 1,5 Millimeter gesunken ist. Sobald die Nadel an Ort und Stelle ist, programmieren Sie den Injektor, um das Virus mit einer Rate von 400 Nanoliterpro Minute zu liefern, und bestätigen Sie, dass das Virus in den Spinalakkord gelangt, indem Sie den Fortschritt der Farbfront beobachten.
Sobald die Injektion abgeschlossen ist, lassen Sie die Nadel für zwei bis fünf Minuten im Rückenmark ruhen, um die Diffusion des Virus zu erleichtern, bevor Sie die Nadel langsam für die Positionierung an der nächsten Injektionsstelle zurückziehen. Nach der letzten Injektion, entfernen Sie das Tier aus dem Wirbelsäulenhalter, um die Entfernung von allen Geräten zu ermöglichen, die verwendet werden, um den Lateralmuskel zu verbreiten. Dann den Muskel mit einer 4,0 chromischen Catgut-Naht schließen und die Haut mit neun Millimeter Wundclips heften.
Vier Wochen nach einer erfolgreichen Injektion wird eine signifikante GFP-Expression in den Neuronen innerhalb der grauen Substanz des Brustrückenmarks an der Seite beobachtet, ipsilateral zur Injektion. In der weißen Materie wird die GFP-Expression in den Axonen in der ipsilateralen Schnur beobachtet, insbesondere in Bereichen, die typisch für die propriospinalen Axone sind. Eine höhere Vergrößerung der Neuronen der grauen Materie zeigt ein Beispiel für eine typische Signalexpression in neuronalen Zellkörpern und Dendriten.
Die GFP-Expression in Neuronen kann auch in Hirnstammkernen beobachtet werden, z. B. innerhalb der pontinen Netzhautbildung. Die Schlüsselfaktoren für ein erfolgreiches Rückenmarks-Injektionsverfahren sind korrektes Wirbel-Targeting und die Sicherstellung, dass das Virus in das Gewebe eindringt Wenn vor diesem Eingriff eine rostrale Rückenmarksverletzung durchgeführt wird, kann eine Direkteinjektion verwendet werden, um Neuronen zu verfolgen, die Verbindungen um die Verletzung wieder herstellen.
