Dieses Video wird detaillierte Protokolle für In-vitro-Formexperimente liefern, um die sekundäre Struktur von RNA-Sequenzen zu bestimmen, die für das Vorhandensein einer RNA, die auf kleine Moleküle abzielt, von Interesse sind. In-vitro-Form ist eine kostengünstige Methode, um die Dynamik jedes Nukleotids auf einem aminogroßen RNA-Element zu verstehen, das in der Regel weniger als 200 Nukleotide ist. Nach der Vorbereitung der RNA-Vorlage, wie im Manuskript beschrieben, Radio-Label-Reverse-Transkriptionsprimer durch Hinzufügen einer Gamma 32P ATP, umgekehrte Transkriptionsprimer.
10XPNK Reaktionspuffer, Polynukleotidkinase und das freie Wasser der RNA in einem 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr in einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Dann bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Sie aktivieren dann die Proben für 20 Minuten seit 65 Grad Celsius und filtern dann die Proben in einer Entsalzungssäule und Zentrifuge 1000 mal G.Add 25 Mikroliter 2XTBE Harnstoffprobenpuffer und mischen.
Senken Sie diese gekennzeichneten Produkte in ein 10%acrylamid-Gel und vermeiden Sie das Ausbluten der Radioaktivität in die oberen Reservoirs. Führen Sie das Gel mit 20 Watt für eine Stunde. Entfernen Sie nach dem Lauf die Glasplatten der Gelkassette.
Legen Sie das Gel auf das Stück Plastikfolie. Falten Sie den Kunststoff auf die Oberseite des Gels, um ein luftdichtes Sandwich zu machen. Legen Sie das Gel-Sandwich auf einen Calcium-Wolfram-Phosphor-Bildschirm und setzen Sie es mit einem imaginären Instrument aus.
Stellen Sie das Gel erneut mit regelmäßigem Licht auf, um zu wissen, wo sich die Ränder des Gels befinden. Verwenden Sie eine Bildverarbeitungssoftware, um die beiden Bilder zu überlagern und die hellen und dunklen Bilder zu überlagern. Machen Sie dann das obere Bild etwas undurchsichtig, um beide Bilder gleichzeitig zu sehen.
Stellen Sie sicher, dass das gedruckte Bild die gleiche Größe wie das eigentliche Gel hat. Richten Sie dann das Gel auf dem gedruckten Bild aus. Schließlich verwenden Sie eine sterilisierte Rasierklinge, um die gewünschten Biegungen aus dem Gel zu schneiden und jedes Stück Gel in einem separaten 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu platzieren.
Um die DNA aus der Gelscheibe durch passive Elution zu gewinnen, fügen Sie 0,3 Milliliter Elutionsniederschlagsmischung zu jedem 1,7 Milliliter-Rohr hinzu. Inkubieren Sie die Rohre in einem radioaktiv-sicheren Behälter auf einem Rotator bei vier Grad Celsius für 16 Stunden. Nach der Inkubation die Flüssigkeit in ein neues 1,7-Milliliter-Rohr geben.
2,5x eiskaltes 200-haltiges Ethanol hinzufügen und die Rohre sechsmal umkehren, um die Flüssigkeit zu mischen. Die Rohre mindestens eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius bebrüten. Nach der Zentrifugierung bei 10, 000g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, entfernen Sie den Überstand sorgfältig durch Pipettieren.
Fügen Sie einen Milliliter 80% Ethanol hinzu, um das Pellet zu waschen. Wirbel für 15 Sekunden und Zentrifuge wieder unter den gleichen Bedingungen. Nach dem Entfernen des Überstandes durch Pipettieren, trocknen Sie das DNA-Pellet fünf Minuten lang lufttrocken.
Fügen Sie 50 Mikroliter des freien Wassers der RNA hinzu und mischen Sie es, indem Sie 10 Mal nach oben und unten pfeifen. Normalisieren Sie die DNA-Konzentration auf etwa 100.000 Zählungen pro Minute pro Mikroliter in einem Szintillationszähler. Um vier Proben für die chemische Modifikation vorzubereiten, fügen Sie acht Picomole rna in 32 Mikroliter0,5 XTE Puffer zu einem 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr hinzu.
Bei 80 Grad Celsius zwei Minuten erhitzen und mindestens eine Minute auf Eis abkühlen lassen. Dann fügen Sie acht Mikroliter 5x Faltmischung hinzu, mischen Sie neun Mikroliter dieser RNA-Mischung in jede der vier PCR-Röhren, die von eins bis vier beschriftet sind. Fügen Sie einen Mikroliter 10%DMSO in die als eine markierte Röhre, einen Mikroliter konzentrierter kleiner Moleküllösung in Tube zwei, einen Mikroliter verdünnter kleiner Moleküllösung in Tube drei und einen Mikroliter Wasser in Tube vier ein.
Inkubieren Sie alle PCR-Röhren bei 37 Grad Celsius in einem thermischen Cycler für 30 Minuten. Direkt vor der beiden Prime OH Modifikationsreaktion einen Mikroliter zweier molarer NAI-Lagerlösung in drei Mikroliter DEPC-behandeltem Wasser verdünnen, um eine 0,5-Molaren-Arbeitslösung zu ergeben. Sofort einen Mikroliter dieser Lösung in die Röhren eins, zwei und drei geben.
Fügen Sie einen Mikroliter 25%DMSO in Tube vier und in einem thermischen Cycler bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Bereiten Sie vier frische 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohre vor und fügen Sie 100 Mikroliter Elutionsniederschlagsmischung und zwei Mikroliter Glykogen in jede Röhre ein. Dann in jede dieser Rohre übertragen die gesamte Flüssigkeit aus den entsprechenden PCR-Röhren.
0,34 Milliliter eiskaltes 200-proof-Ethanol in jedes Rohr geben und fünf Sekunden lang mischen. Legen Sie die Rohre mindestens eine Stunde lang in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Dann zentrieren Sie die Rohre für 15 Minuten bei 14.000 mal G bei vier Grad Celsius.
Ohne das RNA-Pellet zu stören, entfernen Sie den Überstand aus jedem Rohr. Fügen Sie 0,5 Milliliter 80% Ethanol pro Tube hinzu, um das RNA-Pellet und den Wirbel 15 Sekunden lang zu waschen. Nach der Zentrifugierung unter den gleichen Bedingungen wieder entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das RNA-Pellet fünf Minuten lang lufttrocken.
Fügen Sie neun Mikroliter des freien Wassers und der Pfeife der RNA hinzu, die zehnmal nach oben und unten gewirrt werden. Übertragen Sie die modifizierte RNA in vier neue PCR-Röhren und beschriften Sie sie eins bis vier wie im vorherigen Schritt. Fügen Sie jeweils zwei Pikomole RNA in sieben Mikroliter DEPC-behandeltem Wasser zu vier weiteren PCR-Röhren hinzu und kennzeichnen Sie sie mit den Zahlen fünf bis acht.
Fügen Sie zwei Mikroliter der wiederhergestellten radioaktiv markierten Grundierung zu jedem der acht PCR-Röhren hinzu, die eins bis acht markiert sind. Nach dem Erhitzen bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten sofort auf vier Grad Celsius im Thermocycler abkühlen. Fügen Sie vier Mikroliter 5x RT Puffer, einen Mikroliter 0,1 Molar DTT und einen Mikroliter DNTP-Mix zu jedem der Rohre hinzu.
Dann fügen Sie zwei Mikroliter DEPC-behandeltes Wasser in die Rohre eins bis vier. Fügen Sie vier Mikroliter von fünf Millimolar ddATP zu Tube fünf, vier Mikroliter von fünf Millimolar ddTTP zu Tube sechs und vier Mikroliter von fünf Millimolar ddCTP zu Rohr sieben und ein Mikroliter von fünf Millimolar ddGTP und drei Mikroliter DEPC-behandeltes Wasser zu Rohr acht und Pipette vier Mal zu mischen. Nachdem Sie alle PCR-Röhren bei 52 Grad Celsius für eine Minute in einem thermischen Cycler erhitzt haben, fügen Sie jedem Rohr einen Mikroliter Reverse-Transkriptase hinzu und pfeifen es viermal nach oben und unten, um es zu mischen.
Inkubieren Sie die Reaktionen bei 52 Grad Celsius für 20 Minuten im thermischen Cycler. Um die RNA zu hydrolysieren, fügen Sie jedem der Röhren einen Mikroliter von fünf Mol-Natriumhydroxid hinzu und erhitzen Sie sie fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Fügen Sie dann fünf Mikroliter einer Molsalzsäure hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren und die Ethanolausfällung wie zuvor beschrieben zu wiederholen.
Nach der Lufttrocknung des DNA-Pellets für fünf Minuten 10 Mikroliter Wasser und 10 Mikroliter 2xTBE Harnstoffproben-Ladepuffer in 1,7 Milliliter-Rohre hinzufügen und 10 Mal nach oben und unten pfeifen, um wieder aufzulösen. Erhitzen Sie die Proben bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten, dann legen Sie die Rohre auf Eis, bevor Sie auf das Gel. 10 Mikroliter der Probe, die auf Eis gelegt wurde, auf 8%Polyacrylamid-Sequenzierungsgel laden.
Führen Sie das Gel mit 65 Watt für zwei Stunden oder bis der Bodenfarbstoff die 3/4ths des Gels erreicht. Entfernen Sie den Abstandsraum und legen Sie vorsichtig einen Spachtel ein, um die obere silikonisierte Glasplatte zu entfernen. Bedecken Sie das Gel mit einem Stück großem Filterpapier und drücken Sie vorsichtig, damit das Gel am Filterpapier haften kann.
Vom unteren Ende aus heben Sie das Filterpapier an und entfernen Sie das Gel zusammen mit dem Papier von der Glasplatte. Nachdem Sie das Gel wie bisher auf ein Packpapier übertragen haben, trocknen Sie es bei 70 Grad Celsius für eine Stunde mit einem Vakuum, wobei sie sicherstellen, dass mehrere Filterpapiere zwischen dem Gel und dem Trockner verwendet werden. Übertragen Sie das Gel-Sandwich auf eine fotogebleichte Phosphor-Speicherbildschirmkassette und setzen Sie die Radioaktivität des Gels für vier bis 16 Stunden auf den Bildschirm aus.
Schließlich den Phosphor-Speicherbildschirm auf einem Bildverarbeitungsgerät platzieren und mit mittlerer Auflösung ca. 30 Minuten scannen. Nachdem Polyacrylamid-Sequenzierungsgel dem Phosphorspeichersieb ausgesetzt wurde, zeigte ein erfolgreiches Formexperiment eine einzige und intensivste Biegung an der Oberseite des Gels und biegt sich im gesamten Gel bei einer einzigen Nukleotidauflösung ohne Abstrich. Das Gel zeigte auch, dass sich die Intensität einiger Biegungen in Gegenwart kleiner Moleküle änderte, was auf Veränderungen der Basispaarungsstärke hindeutet.
Ein häufiges Problem in der Seitenanalyse ist, dass ein Abstrichbereich, der als Salzfront bekannt ist, in der Mitte des Gels auftreten kann, wahrscheinlich aufgrund einer hohen Konzentration von Salz, DMSO oder einer anderen unerwünschten Substanz in der Belastungsprobe. Dies kann vermieden werden, indem die unerwünschte Substanz durch Ethanolfällung entfernt wird. Eine homogene RNA-Vorlage ist für in vitro Form vorzuziehen.
Wir verwenden Ribosomen an fünf Prime- und drei Prime-Enden, um eine solche RNA zu erhalten. In-Zell-Form kann auch durchgeführt werden, um RNA sekundäre Struktur im zellulären Kontext zu erhalten. Denken Sie daran, in vitro Form kann nicht rekapitulieren in vivo RNA bindende Protein-Wechselwirkungen.
In-vitro-Form ist eine leistungsfähige Methode zum Nachweis von Veränderungen in der RNA-Struktur aufgrund der Anwesenheit eines kleinen Moleküls. Dies geschieht durch Quantifizierung von Änderungen in der Musterstärke von Reverse-Transkriptase-Stopps. Seien Sie vorsichtig, dass alle in diesem Video beschriebenen Experimente an einem autorisierten radioaktiven Arbeitsplatz mit entsprechendem Personenschutz und Plexiglasabschirmung durchgeführt werden.
