Dieses Protokoll vereinfacht und klärt die Methoden zur Implementierung der Selbst-Re-Protein-Synthese durch Nicht-Experten. Ein verbesserter Zugriff auf diese Methoden wird dazu beitragen, die Plattform und die breite Palette von Anwendungen, die sie ermöglicht, zu entvermarkten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Geschwindigkeit, Wirtschaftlichkeit und die Leichtigkeit der Reaktion im Vergleich zu anderen Selbst-Re-Protein-Synthese-Plattformen eingerichtet.
Unsere Plattform kann eine Reihe von Anwendungen ermöglichen, einschließlich funktioneller Genomik, Hythopertesting, Biosensoren, Bildungskits und mit geringfügigen Modifikationen, metabolischer Technik und genetischer Codeerweiterung. Während diese Technik nur grundlegende Laborschulungen erfordert, sollten neue Benutzer planen, sich mit Techniken wie Beschallung für die erfolgreiche Ausführung des Protokolls vertraut zu machen. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie alle Medien und Kultur E.coli-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben vorbereitet.
Legen Sie eine Ein-Liter-Zentrifugenflasche in ein Eiswasserbad. Sobald die Kulturen OD600 3.0 erreicht, gießen Sie die Zellkultur in die gekühlte Flasche. Mit einem Doppelstrahl-Balance, fügen Sie Wasser zu einer zweiten Ein-Liter-Zentrifugenflasche, bis es wiegt das gleiche wie die erste, um ein Gleichgewicht für die Zentrifuge zu schaffen.
Nach dem Vorkühlen der Zentrifuge auf vier Grad Celsius zentrieren Sie die Flaschen bei 5.000 g und bei 10 Grad Celsius für 10 Minuten, um die Zellen zu pellet. Danach langsam abgießen und den Überstand entsorgen. Legen Sie das Zellpellet auf Eis.
Mit einem sterilen Spachtel kratzen Sie das Zellpellet aus der Zentrifugenflasche und geben es in ein kaltes, 50 Milliliter konisches Rohr. Fügen Sie 30 Milliliter kalten S30 Puffer mit zwei Millimolar DTT ergänzt und das Pellet durch Wirbeln in kurzen Ausbrüchen mit Ruhezeiten auf Eis, bis das Pellet vollständig ohne Brocken resuspendiert wird. Danach verwenden Sie ein weiteres 50 Millimeter konisches Rohr mit Wasser gefüllt als Balance, um die Probe bei 5, 000 g und 10 Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugieren.
Gießen Sie den Überstand ab und entsorgen Sie ihn. Das Pellet mit 20 bis 25 Milliliterkaltem S30-Puffer wieder aufhängen. Zentrifuge bei 5.000 g und bei 10 Grad Celsius für 10 Minuten.
Gießen Und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie dann 30 Milliliter S30-Puffer hinzu und setzen Sie das Pellet mit einem Wirbel wie zuvor beschrieben wieder auf. Legen Sie drei vorgewogene, kalte, 50 Milliliter konische Röhren auf.
Mit einem serologischen Pipettenfüller mit einer sterilen Pipette, aliquot zehn 10 Milliliter PelletSuspension in jedes Rohr. Zentrifugieren Sie alle Rohre mit geeigneten Waagen bei 5 000 g und 10 Grad Celsius für 10 Minuten. Danach die Überräube ausgießen und entsorgen.
Wischen Sie vorsichtig das Innere jedes Rohres und jeder Kappe mit einem sauberen Gewebe ab, um den Zugangspuffer zu entfernen, und stellen Sie sicher, dass sie das Pellet nicht berühren. Mit hilfe einer analytischen Waage die Rohre nachwägen und das endgültige Pelletgewicht für jedes Rohr melden. Zunächst fügen Sie jedem Pellet einen Milliliter kalten S30-Puffer mit 2 Millimolar DTT pro Gramm Zellmasse hinzu.
Verwenden Sie einen Wirbel, um die Pellets wie zuvor beschrieben wieder auszusetzen. Dann 1,4 Milliliter jedes resuspendierten Pellets in separate 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre geben. Legen Sie eine Röhre in ein Eiswasserbad in ein Becherglas und positionieren Sie die Beschallungssonde so, dass sie die Böden oder Seiten des Rohres nicht berührt.
Sonicate das Rohr mit der Amplitude auf 50% für 45 Sekunden, gefolgt von 59 Sekunden Ruhe. Achten Sie darauf, die Rohre während der Auszeiten zu schließen und umzukehren. Unmittelbar nach Der Beschallung 4,5 Mikroliter eines Molaren DTT in das Lysat geben.
Invertieren Sie die Röhre mehrmals zu mischen und dann auf Eis legen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, beschallen und fügen Sie DTT für jede Röhre von resuspendierten Zellen hinzu. Zentrifugieren Sie die Proben bei 18 000 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Danach pipette jeder Überstand in einem neuen 1,5 Milliliter Microcentrifuge Rohr, so dass einige Überstand zurücklassen, um sicherzustellen, dass das Pellet nicht gestört wird. Nehmen Sie die Röhren des Überstandes auf die Schüttelplattform eines Inkubators und bebrüten sie bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 U/min für 60 Minuten. Das ist die Ablaufreaktion.
Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie jeden Überstand, ohne das Pellet zu stören, das sie in neue Schläuche überträgt. Erstellen Sie viele 100 Mikroliter Aliquots des Extraktes für die Lagerung.
Erstens Taulösung A, Lösung B, die DNA-Vorlage, der BL21DE3-Extrakt, T7-RNA-Polymerase und ein Aliquot aus molekularem Wasser auf Eis. Als nächstes beschriften Sie die notwendige Menge an Mikrozentrifugenrohren, die für die CFPS-Reaktion benötigt werden. Mischen Sie jedes Reagenz durch Pipettieren oder Wirbeln, dann fügen Sie die Lösung auf die beschriftete Reaktionsröhre, um sicherzustellen, dass nicht Wirbel die Zelle Extrakt, sondern invertieren das Rohr zu mischen.
Stellen Sie sicher, dass die Endreaktion gut gemischt ist und in einer einzigen 15-Mikroliter-Perle an der Unterseite jedes Rohres kombiniert wird. Jede Reaktion ohne Schütteln bei 37 Grad Celsius vier Stunden oder über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren. Zu Beginn erhalten Sie eine 96-Well-Platte und laden Sie 48 Mikroliter von 0,05 Molaren-HEPES bei pH 8 in jeden Brunnen, der für die Quantifizierung benötigt wird.
Entfernen Sie anschließend die Reaktionsrohre aus dem Inkubator. Mischen Sie jede Reaktion, indem Sie nach oben und unten pfeifen und zwei Mikroliter jeder Reaktion in die Brunnen übertragen, die HEPES enthalten. Mischen Sie jeden gut, indem Sie nach oben und unten.
Nachdem alle Reaktionen geladen und gemischt sind, laden Sie die Platte in ein Fluorometer und messen die SFGFP-Endpunktleuchtstoffröhren mit einer Anregungswellenlänge von 485 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 510 Nanometern. Verwenden Sie eine zuvor generierte Standardkurve, um die Konzentration des superfaltierten GFP aus dem erhaltenen Fluoreszenzwertwert zu bestimmen. In dieser Studie wird eine auf Beschallung basierende E.coli-Extraktpräparation untersucht.
Zellpellets und Zellextrakt sind mindestens ein Jahr lang bei minus 80 Grad Celsius stabil. Darüber hinaus kann der Zellextrakt mindestens fünf Frost-Tau-Zyklen ohne signifikanten Produktivitätsverlust durchlaufen. Einige Schritte innerhalb dieses Protokolls können geändert werden, ohne die Gesamtproduktivität des Systems zu beeinträchtigen.
Vor allem können Zellen im Bereich von 2,7 bis 4,0 optischen Dichte bei 600 Nanometern geerntet werden, ohne dass dies einen signifikanten Einfluss auf die Produktivität des Zellextrakts hat. Die DNA-Qualität von Vorlagen ist jedoch eine Quelle der Batch-zu-Batch-Variabilität, die sich auf die volumetrischen Erträge der CFPS-Reaktion auswirkt. Dies wird durch die Reinigung der DNA über einen Midi oder Maxiprep gefolgt von einem zusätzlichen DNA-Reinigungsschritt gelöst.
Das Reaktionsgefäß wirkt sich auch auf die volumetrischen Erträge der CFPS-Reaktion aus. Eine Erhöhung des Flächen-Volumen-Verhältnisses führt zu höheren volumentrumigen Erträgen. Um die volumetrischen Erträge der CFPS-Reaktion zu optimieren und die Zellextrakt-Batch-zu-Charge-Variabilität zu reduzieren, sollte für jede neue Extraktzubereitung eine Magnesiumtitration durchgeführt werden.
Bei Zellextrakten, die aus 30 Milligramm pro Milliliter Gesamtprotein bestehen, beträgt die optimale Magnesiumkonzentration und das Extraktvolumen zur Minimierung des Reagenzverbrauchs und zur Maximierung der Volumenausbeute 10 Millimolar bzw. fünf Mikroliter. Durch Variation der Reaktionsskala können Anwender Methoden verfolgen, die vom Hochdurchsatz-Screening bis hin zu größeren Ausdrücken eines Zielproteins reichen. Diese Technik bietet zwei wesentliche Vorteile: Erstens werden Proteinprodukte schneller überprüft, und zweitens synthetisiert sie schwer, Proteine auszudrücken.
Beispiele sind Proteine, die zytotoxisch sind oder oxidationsmittelierende Bedingungen für ihre Funktion erfordern. Wie bei jedem Laborverfahren sollten alle Reagenzien mit Vorsicht behandelt werden. Darüber hinaus sollten Zentrifugen immer ausgewogen sein und Der Gehörschutz sollte während der Beschallung verwendet werden.
