Das Ziel dieses Videoprotokolls ist die Etablierung eines Quell- und effizienten Protokolls für embryonale Maus-Neural-Stammzellisolation und -kultur. Hallo, ich bin Maryam Sadeghi-Zadeh. Ich bin Masterstudent für Zell- und Molekularbiologie am Royan Institute.
Heute wollen ich und mein Kollege Ihnen zeigen, wie man neuronale Stammzell von 13 embryomausenkinischen Eminenz erntet. Hallo, ich bin Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Ich bin Masterstudent für Zell- und Molekularbiologie in der Stammzellabteilung des Royan Institute for Biotechnology.
Hallo, ich bin Reza Dehghani-Varnamkhasti. Außerdem studiere ich Zell- und Molekularbiologie am Royan Institute. Chirurgische Verfahren umfassen die Ernte von jedem 13 Maus-Embryonen aus der Gebärmutter.
Schneiden sie die Vorderseite des Fontanels des Embryos mit einer gebogenen Nadelspitze, die das Gehirn aus dem Schädel extrahiert. Mikro-Sektion des isolierten Gehirns, um die ganglionische Eminenz zu ernten. Dissoziation des geernteten Gewebes in einem neuronalen Stammzellmedium, um eine einzelzellige Suspension zu erhalten.
Und schließlich, Beschichtung von Zellen in einer Suspensionskultur, um Nervenzellen zu erzeugen. Reinigen und desinfizieren Sie die Haut des Bauchbereichs durch Sprühen mit 70% Ethanol. Kontrollieren Sie die Haut nach oben Bauch und dann schneiden Sie die Haut und betonte Gesichtsmitschnitt mit Schere, um Bauchhöhle und Gebärmutterhörner aufzudecken.
Entfernen Sie die Gebärmutterhörner, die die Embryonen enthalten, per Schere und übertragen Sie sie in ein 50 ml konisches Rohr mit 25 ml kaltem HEPES MEM Puffer. Legen Sie das konische Rohr unter die laminale Durchflusshaube. Öffnen Sie die Kappe unter der Haube.
Bringen Sie die Uterushörner aus der Röhre und spülen Sie dreimal mit genügend Volumen des frischen kalten HEPES MEM Puffers, um Schmutz und Blut zu beseitigen. Übertragen Sie das Gebärmuttergewebe in eine 10 cm Petrischale mit 7 bis 10 ml kaltem HEPES MEM Puffer. Öffnen Sie die Uterushörner mit einer feinen Schere und übertragen Sie Embryonen in eine neue Schale, die 7 bis 10 ml kalten HEPES MEM Puffer enthält.
Nun stellen Sie die 10 cm Schale mit Embryonen unter das Seziermikroskop für den Mikro-Sektionsbetrieb. Biegen Sie die Spitze einer Spritzennadel, indem Sie ihre Spitze auf einen Stahlskalpellklingengriff drücken. Biegen Sie die Spitze der Nadel, bis die Spitze in einem Winkel von 70 bis 90 Grad gebogen ist.
Überprüfen Sie die Spitze der Nadel unter dem Sezieren des Mikroskops, um die Biegung an der Spitze der Nadel zu sehen. Natürlich haben Embryonen dabei eine seitliche Position. Ohne ihre Position zu ändern, hielten Sie den Hals und Körper des Embryos mit feiner Zange und legen Sie dann den gebogenen Teil der Nadel tief in die Vorderseite des Fontanels des Embryokopfes.
Dort würde es eine kleine Blutung oder ein Blutgerinnsel geben. Bewegen Sie die Nadelspitze oberflächlich, während sich der gebogene Teil innerhalb der Wölbung in Richtung Stirn und dann in Richtung hinterden Kopf befindet. Achten Sie darauf, durch die Haut und den Schädel zu schneiden, und nicht das darunter liegende Gehirn zu beschädigen.
Drücken Sie die Haut mit der Nadelspitze seitlich, um das Gehirn zu entdecken. Setzen Sie die Nadel von der seitlichen Seite der Haut auf den unter dem Rahmen von der seitlichen Seite der Haut in den Bereich unter dem Gehirn. Und dann entfernen Sie das Gehirn von dieser Kopfhaut, indem Sie es schieben, um aus dem sezierten Schädel zu kommen.
Die ganglionische Eminenz wird im Video mit ihren medialen und seitlichen Teilen deutlich dargestellt. Halten Sie das Gehirn stabil mit den Pflegezangen und dann mit Mikroschere, um den Kortex jeder Hemisphäre zu schneiden, um die ganglien Eminenz zu entlarven. Halten Sie das Gehirn und legen Sie sezierte ganglionische Eminenz in die 15 ml Zentrifugenröhre mit neuronalen Stammzellenmedien.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Gehirn mikroseziert wurde. Schneiden Sie sezierte ganglionische Eminenz, indem Sie die Pipettespitze gegen den Boden des Rohres und Pipette die Suspension nach oben und unten für 2 5 Mal, um das Gewebe zu brechen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 110 g für 5 Minuten.
Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml 0,05%Tube in EDTA wieder aus. Inkubieren Sie die Zellsuspension in einem 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Und dann fügen Sie ein gleichwertiges Volumen von Soja-Trypsin-Hemmer, um Trypsin-Aktivität zu stoppen.
Pipette die Zellsuspension nach oben und unten, um sicherzustellen, dass das Trypsin vollständig inaktiviert wurde. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 110 g für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml vollständiger neuronaler Stammzellmedium und zählen Sie die Anzahl der Zellen.
Die Zellen an neuronalen Stammzellenmedium in den geeigneten Gewebekulturkolben der Größe einschließen. 5 ml 2T25, 20 ml auf T75 und 40 ml auf T175-Flaschen übertragen. Neurosphären erscheinen nach 3 Tagen Kultur bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2.
Um die Neurosphären zu saugen, übertragen Sie das Medium mit schwebenden Neurosphären für 5 Minuten auf die Zentrifuge zu Zentrifuge bei 110 g und entsorgen Dann den Überstand. Bei 1 ml 0,05% Trypsin EDTA und bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren. Dann inaktivieren Sie das Trypsin mit Sojatyrpsin-Inhibitor und Pipette die Neurosphären sanft nach oben und unten, um sie zu einzelnen Zellen zu machen.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 110 g für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 1 ml neuronalen Stammzellenmedium. Diese Zellen sind bereit für die Kultur des nächsten Schritts auf Laminat und voll beschichtete Oberfläche für fortgeschrittene Experimente.
Durch den Anbau von einer Million primärer neuronaler Stammzellen nach sieben Tagen wird die Anzahl der Zellen auf drei bis vier Millionen ansteigen. Nach sechs bis sieben Tagen sollten die Kugeln zwischen 150 und 200 Mikrometer Durchmesser messen und in Abwesenheit von bFGF und EGF für die neuronale Differenzierung für die Subkultur auf Laminat-Poly-Ornithin-beschichteten Schalen bereit sein. Flow Cytometry Assay Ergebnisse zeigen, dass fast 95% der Zellen, die die Neurosphären bildeten Nestin-positiv, die ein bekannter Marker für neuronale Stammzellen ist.
Assays mit Beta-Tubulin III und Ganglio-Faserprotein-Antikörpern zeigen, dass durch die Kultivierung neuronaler Stammzellen auf beschichteter Oberfläche etwa 94% neuronaler Phänotyp und etwa 5% gliaren Phänotyp zeigen. In nur diesem kurzen Video eine Labortechnik zur schnellen Isolierung der neuronalen Stammzelle von 13 Mausembryonk-Ganglionen-Eminenz. Ich hoffe, Dass Sie in Ihrer neuronalen Stammzellkultur erfolgreich sein werden.
